Наряду с половым зародышем, растительный организм способен формировать соматические зародыши на различных репродуктивных и вегетативных органах на всех стадиях своего развития. Введено понятие "эмбриоидогения" - новая категория вегетативного размножения in vivo и in vitro. Элементарной структурной единицей эмбриоидогении является соматический зародыш (эмбриоид). Сравнительный анализ соматических и половых зародышей, развивающихся в естественных условиях я в культуре in vitro, позволяет говорить о параллелизме в их развитии, который проявляется в основных закономерностях морфогенеза. И половые, и соматические зародыши характеризуются полиморфизмом, переходными формами, а также аномалиями. Развитие полового зародыша, а также соматического зародыша в природных условиях и in vitro в основном подчиняется закономерностям деления клеток и законам эмбриологии. Генезис и структура соматического зародыша в природе таксоноспецифичны. Особенности развития соматического зародыша в культуре зависят от происхождения инициальной клетки, от ее положения и детерминации в системе материнского растения, а также от степени ее тотшютентности и условий культивирования. Вегетативное размножение у цветковых растений в естественных условиях и в культуре осуществляется двумя разными по морфологической природе структурными единицами: не только почками, как считалось ранее, но и соматическими зародышами (эмбриоидами) или адвентивными почками. Несмотря на то, что адаптивная эволюция привела к разнообразию способов эмбриогенеза, эмбриоидогенеза и геммогенеза, самые первые этапы развития растения протекают сходно.

Длительный процесс адаптивной эволюции привел к возникновению большого разнообразия репродуктивных структур, обеспечивающих семенное и вегетативное размножение растений. Наряду с половыми зародышами существуют адвентивные почки, пропагулы, специализированные побеги, бульбы, соматические зародыши и т.д. Рассматривая единство и разнообразие путей морфогенеза, следует обратить особое внимание на вопрос о параллелизме путей развития полового и соматического зародышей. Практически очень мало работ, посвященных роли соматического зародыша в естественном размножении растений. До сих пор неясно, можно ли говорить о сходстве первых этапов развития индивидуума при различных путях морфогенеза - эмбриогенезе, эмбриоидогенезе и гемморизогенезе [1-3] (рис. 1).

Дискуссионным является вопрос, насколько морфогенез соматического зародыша соответствует морфогенезу полового зародыша, т.е. в какой степени он подчиняется закономерностям развития полового зародыша: [4; 5, с. 97] и пролиферации. Процессы морфогенеза в культуре in vitro могут быть познаны лишь в сравнении с развитием соматического зародыша в естественных условиях или же полового зародыша и почки. В литературе обсуждаются лишь отдельные аспекты морфогенеза полового и соматического зародышей, развивающихся в культуре, вопросы терминологии, связанные с зародышеподобными структурами, а также их классификация до сих пор не решены [2, 6-11].

Согласно Swamy и Krishnamurthy [6] аналогия в развитии полового зародыша и эмбриоида отсутствует. Они полагали, что эмбриоид лишен основных "классических" признаков, присущих половому зародышу, и по своей морфологии ближе к адвентивной почке, чем к половому зародышу. Между тем за последние десятилетия получено много данных по развитию соматического зародыша как в естественных условиях, так и в культуре in vitro, в свете которых становится ясно, что приведенные Swamy и Krishnamurthy признаки половых зародышей, отсутствующие у соматических не всегда пригодны для оценки морфологического статуса не только эмбриоида, но также и для полового зародыша.

Системный подход впервые позволил сопоставить характер формирования полового и соматических зародышей, развивающихся в естественных условиях и в культуре [17, 12, 13]. С помощью сравнительного эмбриологического метода установлена новая категория вегетативного размножения цветковых растений - эмбриоидогения [7, 8, 10, 14-17].

Эмбриоидогения является одним из основных типов гомофазной репродукции цветковых растений, который имеет место, как в природе, так и в культуре in vitro. Она включает монозиготическую кливажную эмбриоидогению. нуцеллярную и интегументальную эмбриоидогенную, некоторые формы гаметофитного апомиксиса и гомеофазной вивипарии. При этом из соматических клеток формируется эмбриоид - зародышеподобная биполярная структура, которая является зачатком нового организма. Тенденция к образованию эмбриоидов характерна для всех этапов онтогенеза цветковых растений, начиная с зиготы. Эмбриоиды могут возникать в естественных условиях в семенах или на стеблях, листьях и корнях развитого спорофита (например, у видов Bryophyllum). В семени эмбриоиды образуются в результате "расщепления" (cleavage) зиготы и полового зародыша (дочернего спорофита), а также в результате интегументальной и нуцеллярной эмбриоидогении (из тканей материнского спорофита, граничащих с зародышевым мешком). Выделены два типа эмбриоидогении в зависимости от места образования эмбриоидов: репродуктивная (в цветках, семенах) и вегетативная (на листьях, стеблях и корнях).

Для изучения морфогенеза соматических зародышей, развивающихся в культуре, нами использован сравнительный анализ следующих структур в процессе их формирования: 1) инициальные клетки полового и соматических зародышей; 2) половые зародыши растений, принадлежащих к таксонам с различными типами эмбриогенеза; 3) соматические зародыши и проростки, различающиеся местом возникновения (семя, лист, стебель, корень) в естественных условиях. Кроме того, необходимо исследование соматических зародышей, из различных тканей растений разных таксонов, отличающихся по способу образования и развития в культуре.

Нельзя отрицать тот факт, что развитие инициальных клеток как полового, так и соматического зародышей в большой степени обусловливает последующий ход эмбрио- и эмбриоидогенеза. Поэтому характеристика их и сейчас остается одной из основных задач морфогенеза [18-20]. (рис. 2).

Системный подход предполагает сравнение инициальных клеток соматического зародыша в культуре с инициалями, которые в естественных условиях дают соматические зародыши в семени или на вегетативных органах. Кроме того, необходимо сравнение инициальных клеток соматических зародышей, развивающихся в естественных условиях и в культуре, с различными стадиями развития яйцеклетки и зиготы (рис. 2). В связи с этим следовало выяснить, во-первых, какую клетку зародышевого мешка - яйцеклетку (гамету) или зиготу (новый спорофит), можно рассматривать как аналог инициальной клетки соматических зародышей. Далее существенно, в какой фазе митотического цикла находятся эти клетки и каков темп прохождения ими фаз митотического цикла (например, интерфазы).

Некоторые исследователи инициальных клеток соматического зародыша (in vitro) часто сравнивают их с яйцеклеткой или зиготой. Однако у эмбриологов, изучающих развитие зародышевого мешка и процесс оплодотворения, нет полной ясности относительно фаз развития самой яйцеклетки и зиготы, хотя в отдельных работах используют термины "незрелая" и "зрелая зигота" [21-23]. Сравнение соматической инициальной клетки как с яйцеклеткой, так и с зиготой правомерно. Как известно, яйцеклетка некоторых видов растений в природных условиях может дать партеногенетический зародыш. Однако не ясен вопрос о том, действительно ли яйцеклетка в случае ее партеногенетического развития является гаметой по своему внутреннему строению, или она в этом смысле ближе к зрелой зиготе.

Сравнение инициалей нуцеллярных, интегументальных, кливажных соматических зародышей, образующихся на растении в природе, с яйцеклеткой или зиготой является более корректным, чем их сравнение с инициалями соматического зародыша in vitro, поскольку в первом случае инициали соматического и полового зародышей развиваются в системе целого организма.

Детальное сравнительное изучение генезиса яйцеклетки и зиготы у разных видов цветковых позволило уточнить процесс их развитии [21-24] и более детально характеризовать сложные структурные преобразования, связанные с протеканием их специализации, дифференциации и дедифференциации, а также с частичной потерей тотипотентности и ее восстановлением (рис. 2).

В зародышевом мешке Polygonum-типа развития первые этапы формирования яйцеклетки у многих представителей цветковых относительно единообразны, инициали яйцеклетки морфогенетически сходны и тотипотентны (рис. 3). Они имеют оболочку, центрально расположенное ядро и характерную для меристематической клетки степень вакуолизации. По мере превращения инициали яйцеклетки в сформированную, а затем в зрелую яйцеклетку, увеличиваются ее размеры, меняется форма, происходит становление полярности и симметрии (рис. 4). При этом свойство тотипотентности постепенно утрачивается. Для зрелой, т.е. дифференцированной, специализированной яйцеклетки обычно характерны особый тип вакуолизации цитоплазмы, изменение положения ядра и преобразование оболочки (в апикальной части). Эти признаки являются таксоноспецифичньми. Инициаль зиготы - зрелая специализированная яйцеклетка, в цитоплазму которой вошел спермий - триггер, под воздействием которого начинается дедифференциация и процесс дальнейшего развития зиготы.

Таким образом, в системе "яйцеклетка-зигота" последовательно происходят меристематизация, дифференциация, специализация, дедифференциация и снова меристематизация. Вероятно, только те стадии развития системы "яйцеклетка-зигота", которые отличаются меристематичностью и способностью к пролиферации, можно сравнивать с инициалями соматического зародыша, развивающимися как в природных условиях на растениях, так и в культуре (рис. 2).

Большое влияние на развитие инициальных клеток оказывают внешние условия их формирования. Инициаль яйцеклетки, а также незрелая и зрелая яйцеклетка, как и зигота, находятся в сложной зависимости от окружающих клеток. В процессе генезиса яйцеклетка и зигота становятся изолированными и относительно автономными. Кроме того, яйцеклетка находится в сложной системе зародышевого мешка, которая сильно различается у разных таксонов по характеру развития (выявлено существование 16 типов зародышевых мешков). Тип зародышевого мешка в значительной степени определяет полярность и симметрию яйцеклетки, зиготы и характер первого деления (симметричный или асимметричный).

Инициальные клетки соматических зародышей различных видов цветковых в природных условиях относительно единообразны. Клетки, из которых развиваются эмбриоиды, во всех системам имеют ряд общих признаков, характерных для быстро делящихся меристематических клеток: малые размеры, плотная цитоплазма, крупное ядро с заметно увеличенным ядрышком и наличие мелких вакуолей. Гистохимические и ультраструктурные их особенности свидетельствуют об интенсивном синтезе РНК и метаболической активности [25; 26, с. 24—27]. Имеется определенное сходство инициалей соматического зародыша, образующихся в природе, с инициалью яйцеклетки и зрелой зиготой. Они обычно подчиняются общим закономерностям деления клетки и эмбриогенеза, так как протекают в системе целого индивидуума. Это, вероятно, и обеспечивает последующее нормальное развитие соматического зародыша и формирование проростка.

Проследить развитие инициальных клеток соматических зародышей в культуре весьма сложно, так как в большинстве случаев эксплант является гетерогенным, поскольку инициальные клетки различаются по своему происхождению (рис. 2). В культуре ткани существуют две модельные системы, различающиеся по характеру взаимодействия клеток: каллусная и суспензионная культуры. Каллусная культура отличается более жесткими связями между клетками, т.е. периферические клетки чаще, чем нижележащие, становятся компетентными к образованию соматических зародышей. Полярность и деление в этих клетках обычно определяются их положением по отношению к поверхности каллуса (например, у злаков).

В литературе встречались указания на то, что изоляция отдельных клеток каллуса (например, у Daucus [27], Citrus [28]) способствует их переходу к эмбриогенезу, что соответствует, вероятно, относительно изолированному состоянию зрелой зиготы в зародышевом мешке. Однако наблюдения на других видах не подтвердили, что это явление имеет общий характер [29-31].

Согласно гипотезе, предложенной Sharp с соавт. [31] и разработанной Evans с соавт. [33] и Sharp с соавт. [34], эмбриоиды in vitro образуются клетками, которые были детерминированы еще до их эксплантирования; необходим лишь триггер, стимулирующий их морфогенез. Непрямой эмбриоидогенез in vilro характерен для клеток, требующих пролиферации и дифференциации. В обеих системах дифференциация и специализация инициальных клеток и самого зародыша в значительной степени определяются критической массой этих клеток, каллуса и структур зародыша (апекса стебля, семядолей, корня), образующихся в культуре in vitro [2, 18, 35, 36]. Возможно, что определенную роль играет строение клеточных стенок в каллусе, в частности их лигнификация [37]. Представляют также интерес наблюдения над инициальными клетками в суспензионной культуре Dаucus carota [38]. Эти клетки перед делением уже проявляют полярность, имеют большую вакуоль и ядро, оттесненное к оболочке клетки.

В связи с недостатком данных по морфогенетическим процессам в клетках экспланта очень сложно сравнивать развитие инициалей соматических зародышей в культуре in vitro с развитием яйцеклетки или зиготы in vivo. Тем не менее, даже весьма неполные данные позволяют говорить о сходстве инициальных клеток половых зародышей и соматических зародышей в этих системах. Получение в культуре соматических зародышей у разных таксонов зависит от полноты нашего знания генезиса инициальных клеток и их основных характеристик (фаза митотического цикла, строение оболочки, состояние цитоплазмы, количество и распределение органелл и т.д.) (рис. 2-4). Вместе с тем, накопление таких данных позволит более корректно сравнивать инициальные клетки соматического зародыша in vitro с инициальными клетками полового и соматического зародышей в естественных условиях. Однако следует иметь в виду, что длительное культивирование соматических клеток может, например, изменить структурную организацию митохондриального генома [39], увеличить полиморфизм клеток и тканей [40], привести к возрастанию частоты индуцированных точечных мутаций и к варьированию изменчивости тканей от диплоидных до миксоплоидных [41]. Длительно культивируемые клетки растений могут даже служить моделью для изучения особенностей эволюции генома [42]. Не исключено, что на характер развития инициальных клеток в культуре тканей может оказать влияние стресс, вызывающий изменения белкового метаболизма [43].

Высокая тотипотентность, свойственная зрелой зиготе, сохраняется и в клетках сa и сb, вклад которых в построение тела зародыша весьма разнообразен [44, с. 60-63]. Используя этот признак, Schnarf [45, с. 179-254] создал классификацию типов эмбриогенеза, выделив шесть основных типов, которые были дополнены еще двумя типами: Paeoniad [46,47] и Graminad [48-50]. При развитии зародыша происходит дифференциация гистогенов и специализация отдельных комплексов клеток: тотипотентность сохраняется лишь в отдельных клеточных кластерах зародыша, проростка и растения.

Soueges [51] выявил в зародышах различных видов инициали эпифизиса и гипофизиса, из потомства которых образуются соответственно апексы побега и корня, и возникает морфологическая ось. Формирование этих структур обычно происходит на ранних стадиях развития зародыша, но время их дифференциации таксоноспецифично. Можно описать по крайней мере пять групп зародышей, различающихся по этому признаку (рис. 5):

1 группа - имеются инициали эпифизиса и гипофизиса и развитые из них структуры (например, Geum rivale [51]) (рис. 5. /);

2 группа - имеются только типичная инициаль гипофизиса и образованные ею структуры, эпифизис отсутствует (например. Arabidopsis thaliana [52]; Capsella bursa-pastoris [53]) (рис. 5,3; 5,4);

3 группа - имеются только типичная инициаль эпифизиса и образованные ею структуры, гипофизис отсутствует (например, Polemonium caeruleum [51,54] (рис. 5,2).

4 группа - отсутствуют типичные инициали эпифизиса и гипофизиса и образованные ими структуры (например, Роасеае [51]) (рис. 5,5; 5,7);

5 группа - у некоторых видов орхидных отмечены только инициали эпифизиса и (или) гипофизиса (например. Platantera bifolia [55]; Gimnadenia conopsea - [56]) (рис. 5, 6).

У зародышей первых четырех групп формируется полярная ось, апексы побега и корня (в первых трех группах - главный корень, а в четвертой - адвентивный). В последней пятой группе в зрелом зародыше возникает морфологическая полярность, однако, апексы побега и корня морфологически не выражены. Половые зародыши в ходе эмбриогенеза обнаруживают полиморфизм. У представителей некоторых таксонов апексы побега и корня могут формироваться без участия специфических инициальных структур (эпифизиса и гипофизиса). Кроме того, у некоторых видов в половом зародыше вместо главного корня образуются адвентивные корни, а иногда корень вообще может не развиваться. Таким образом, половые зародыши, как и эмбриоиды, могут быть лишены основных "классических" структур (например, гипофизиса, эпифизиса, суспензора, главного корня и т.п.) (рис. 5).

Уникальным примером образования соматического зародыша в семени in vivo (особая форма монозиготической кливажной эмбриоидогении) является зародыш Paeonia (рис. 6,1). Развитие полового зародыша в зародышевых мешках всех видов пеона заканчивается на стадии образования эпидермиса в ценоцитно-клеточной структуре. Далее на базе полового зародыша образуется множество соматических зародышей из отдельных клеток его эпидермиса, т.е. осуществляется клонирование полового зародыша. В процессе развития семени в результате конкурентного развития зародышей остается лишь один зрелый соматический зародыш, по характеру своего образования и морфогенеза ничем не отличающийся от полового зародыша типичного двудольного растения [47, 57]. Уже на стадии инициальной клетки начинается становление полярной оси. Затем происходит нормальное развитие всех гистогенов корня и побега. Соматический зародыш Paeonia является прекрасной моделью для изучения нормального протекания соматического эмбриогенеза по типу Asterad no классификации Johansen [58]. "Правильность" строения соматического зародыша Paeonia. на наш взгляд, определяется формированием его инициальных клеток в зародышевом мешке, полярностью и строением зародышевого мешка и семязачатка, под влиянием которых и развивается эмбриоид. Вероятно, развитие нуцеллярных и интегументальных соматических зародышей определяется этими же факторами. Хотя первые деления в них часто происходят нерегулярно, отсутствуют инициали гипофизиса и эпифизиса и их центры (рис. 6. 2), однако развитие эпидермиса, апексов побега и корня и дифференциация главного корня протекают так же, как и у половых зародышей |26,. с. 37-39. 59]. Следовательно, в случае Раеonia строение соматического зародыша и характер его морфогенеза соответствуют таковым у полового зародыша.

Развитие соматического зародыша из эпидермальных клеток листа описано у Crassula multicava [60]. Несмотря на отсутствие типичных инициалей эпифизиса и гипофизиса и их структур, развитие апексов побега и корня в этих зародышах происходит в основном так же. как и у половых зародышей, различающихся по признаку присутствия или отсутствия эпифизиса и гипофизиса.

У видов Bryоplуllum зародыши, образующиеся на листе, не имеют инициалей гипофизиса и эпифизиса и их структур (рис. 6,4; рис, 7). Однако их морфогенез проходит "глобулярную", "сердечковидную" и "торпедовидную" стадии, что говорит скорее об их принадлежности к соматическим зародышам или переходной форме между почкой (образование адвентивных корней вместо главного) и зародышем. Морфогенез этих структур указывает на сходство с половым зародышем злаков [61].

Таким образом, анализ соматических зародышей, развивающихся в естественных условиях (в семени и на вегетативных органах) у представителей разных таксонов, говорит о том, что их строение и генезис таксоноспецифичны и, вероятно, в значительной степени определяются местом формирования их инициальных клеток, а также условиями, в которых происходило развитие индивидуума и всей популяции в целом. Наличие у некоторых типов эмбриоидов, например, у Bryophyllum, некоторого морфогенетического сходства с адвентивной почкой (отсутствие главного корня и развитие адвентивных корней) подтверждает существование переходных форм между этими двумя структурами.

Две модельные системы для получения соматических зародышей in vitro (суспензионная и каллусная) различаются по многим показателям, что обусловливает как различное строение и поведение инициальных клеток, так и генезис всего соматического зародыша. Рассмотрим развитие соматических зародышей in vitro у некоторых видов цветковых растений, контрастирующих по ряду признаков. В каллусной культуре пшеницы (Triticum aestivum) [16] закладывается меристематическая зона, которая состоит из рядов клеток, строго ориентированных по отношению к поверхности каллуса. В дальнейшем клетки этой зоны становятся инициальными клетками соматических зародышей (рис. 8).

Сравнительный анализ развития соматических и половых зародышей на ранних этапах показал, что первые деления протекают сходно, хотя и наблюдается некоторая их вариабельность, сохраняющаяся на последующих этапах эмбриогенеза (Graminad-тип) (рис. 9). В некоторых соматических зародышах отмечено изменение в закладке первых перегородок, что, вероятно, приводит к нарушению нормального гистогенеза, а впоследствии и к гибели эмбриоидов. Наряду с этим возможно образование нормальных эмбриоидов, напоминающих половой зародыш злаков.

Сравнение развития соматического зародыша Aconitum в каллусной культуре in vitro с развитием полового зародыша выявило их относительное сходство (тип Onagrad) [12]. Однако наблюдались и различные аномалии, например, ранняя дифференциация элементов ксилемы на стадии "сердечка", что может быть вызвано аномалиями на предшествующих стадиях развития соматического зародыша. У Ranunculus sceleratus (рис. 6,3) соматические зародыши были получены in vitro путем культивирования цветочных почек [29,30]. Развитие их соответствовало типу Onagrad, но суспензор не был дифференцирован, в отличие от половых зародышей у этого вида. Полученные соматические зародыши успешно развивались in situ, причем на гипокотиле проростков также шло образование эмбриоидов из клеток эпидермиса. Соматические зародыши Daucus carota в суспензионной и каллусной культурах, [2, 37] также проявили относительное сходство в развитии с половыми зародышами.

Приведенные выше данные показывают, что морфогенез полового зародыша таксоноспецифичен. Пластичность клеток зародыша весьма высока, что, вероятно, определяется их тотипотентностью и ведет к глубоким морфогенетическим перестройкам на разных этапах развития зародыша и проростка. Такие перестройки могли быть вызваны нарушением определенных морфогенетических корреляций на клеточном, тканевом, органном и организменном уровнях. Эти изменения могут проявляться на самых первых этапах развития зародыша (нерегулярность делений, различное участие потомства клеток сa и сb в построении тела зародыша), на средних (отсутствие гипофизиса и эпифизиса, суспензора) и поздних этапах (полное отсутствие корня или замена его на адвентивные корни). Обнаружены структуры (так называемые переходные формы [62]), имеющие признаки зародыша (например, наличие глобулярной, сердечковидной и торпедовидной стадий развития) и почки (образование адвентивных корней) у Nelumbonaceae, Ceratophyllaceae. Poaceae [63-71]. В ходе перестроек, происходящих в развивающемся половом зародыше, изменяется время появления первичной полярности, а также становится возможной смена ее вторичной полярностью при образовании проростка. Весь комплекс перечисленных признаков можно трактовать как свидетельство возможных эволюционных тенденций к переходу от "классического" типа полового зародыша к почке.

Полиморфизм, присущий половым зародышам в природе, проявляется и при образовании зародыша в культуре; никаких принципиально новых путей развития in vitro не обнаружено. Низкий выход регенерантов in vitro объясняется тем, что в культуре выявляются и те формы, которые были отбракованы в ходе эволюции у зародышей тех или иных видов растений.

Следующие причины затрудняют получение данных по всем этапам развития зародыша: а) отсутствует метод, позволяющий выделить инициальные клетки, сходные по своему генезису и по положению в системе ткани, органа и организма; б) недостаточна информация по анатомии и морфологии проростков, возникших из соматических зародышей (процент нормальных и аномальных растений), чтобы выявить причины снижения выхода регенерантов; в) недостаточно работ по сравнению соматического зародыша in vitro с соматическим в естественных условиях и с половым зародышем.

1. Существуют два типа зародышей как в природе, так и в культуре in vitro: половые зародыши и эмбриоиды, которые различаются по своему происхождению.

2. Аналогом инициальной клетки диплоидного соматического зародыша in vitro и in vivo, вероятно, можно считать инициаль яйцеклетки (как и в случае партеногенеза) или зрелую зиготу, прошедшую сложный путь морфогенетических преобразований и способную к пролиферации. Высокая степень тотипотентности - основное свойство всех инициальных клеток.

4. Генезис и структура соматического зародыша в природе таксоноспецифичны. Возможно, они определяются местом формирования его инициальной клетки, а также условиями развития материнского растения. Особенности развития соматического зародыша in vitro зависят от происхождения инициальной клетки и от ее положения в материнском растении, а также от уровня ее тотипотентности и условий культивирования.