633.11:581.143.5

АНДРОГЕННЫЕ ЭМБРИОИДЫ И КАЛЛУСЫ ПШЕНИЦЫ:

ДАННЫЕ СКАНИРУЮЩЕЙ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ

Н.Н.Круглова, В.Ю.Горбунова, С.Н.Абрамов, О.А.Сельдимирова

Институт биологии Уфимского научного центра РАН,

450054 Уфа, пр. Октября, 69

Методом сканирующей электронной микроскопии исследована поверхность андрогенных новообразований (эмбриоидов и каллусов) пшеницы на разных стадиях их развития. Показано, что эмбриоид характеризуется упорядоченным делением клеток уже с ранних стадий развития, тогда как каллус уже на ранних стадиях представлен беспорядочным скоплением клеток. Эта тенденция сохраняется в ходе дальнейшего развития андрогенных новообразований. Сканирование поверхности так называемых вторичных эмбриоидов подтвердило эти наблюдения.

Андрогенез in vitro - процесс образования гаплоидного растения (спорофита) из микроспоры или клеток пыльцевого зерна (гаметофита высших растений)(Guha, Maheshwari, 1964). Этот уникальный феномен связан с переключением развития спорогенных клеток с обычного для них гаметофитного пути на принципиально иной - спорофитный путь развития (Суханов, 1983; Heberle-Bors, 1985; Батыгина и др., 1992, 1994; Горбунова, 1993).

Различают прямой и непрямой андрогенез in vitro. При прямом андрогенезе in vitro растение-регенерант возникает из микроспоры или клеток пыльцевого зерна через формирование зародышеподобной структуры - эмбриоида. При непрямом андрогенезе in vitro микроспоры или клетки пыльцевого зерна образуют каллус, который дает начало растению-регенеранту после переноса на среду, индуцирующую органогенез. Эмбриоиды и каллусы предложено называть андрогенными новообразованиями (Горбунова и др., 1992, 1993).

К настоящему времени накоплен значительный фактический материал и опубликованы обзорные статьи по различным аспектам изучения андрогенеза in vitro - морфологическим, генетическим, физиологическим, биохимическим, цитологическим (Sunderland, Dunwell, 1977; Шамина, 1981; Heberle-Bors, 1985; Ермаков, Матвеева, 1986; Sangwan, Sangwan-Norreel, 1987; Schumann, 1987; Дьячук, Дьячук, 1989; Муромцев и др., 1990; Горбунова, 1993; Круглова, Горбунова, 1996; Круглова и др., 1995 и др.). Однако ультраструктурный анализ этого феномена как в отечественной, так и зарубежной литературе достаточно ограничен, особенно это касается злаков (например, Сhen et al., 1984; Barnabas et al., 1987; Абрамов и др., 1991; Galieva et al., 1992; Абрамов, Круглова, 1997). В полной мере этот вывод относится к изучению поверхности андрогенных новообразований с применением метода сканирующей электронной микроскопии.

Метод сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) - один из современных методов цитологических исследований биологических объектов. Этот метод относится к группе принципиально новых методов неразрушающей микроскопии, которые позволяют получить объемное изображение и разнообразную информацию о свойствах поверхности изучаемых объектов (Tanaka, 1989; Landfold et al., 1990; Haggis, 1992; Whelan, Kokko, 1992; Миронов и др., 1994; Takayama, Azuma, 1995). По достигнутому разрешению (1-2 нм) метод СЭМ сопоставим только с рентгеноструктурным анализом, но в отличие от него не требует специальной кристаллизации объектов. Кроме того, в отличие от просвечивающей (трансмиссионной) электронной микроскопии, образцы при сканировании не разрушаются электронами высоких энергий (Миронов и др., 1994).

В данной статье изложены результаты исследования методом сканирующей электронной микроскопии поверхности андрогенных новообразований (эмбриоидов и каллусов) пшеницы на разных стадиях их развития.

Материал и методы исследования

Объектом исследования послужили андрогенные новообразования (эмбриоиды и каллусы), полученные в результате культивирования in vitro пыльников яровой мягкой пшеницы сорта Sonalika.

Культивирование изолированных пыльников пшеницы проводили по разработанной нами методике (Горбунова, Круглова, 1988). Следует отметить тот факт, что на начальных этапах культивирования (как правило, в первые 21 сут эксперимента) андрогенные новообразования находятся внутри пыльника, а затем появляются на поверхности пыльника в результате механического разрыва стенки гнезда растущей массой клеток.

Фиксацию и подготовку андрогенных новообразований для исследования их поверхности методом СЭМ проводили согласно методике, любезно предоставленной лабораторией эмбриологии растений Ботанического института РАН (Санкт-Петербург), в собственной модификации. Электронопроводящий слой создавали термическим напылением золота. Объекты изучали с применением сканирующего электронного микроскопа марки JSM 840A.

Результаты и обсуждение

Однако авторы всех проанализированных работ исследовали поверхность эмбриоидов и каллусов, уже "вышедших" из гнезда пыльника на его поверхность. Предложенная нами модификация метода СЭМ позволила впервые получить данные о поверхности андрогенных новообразований пшеницы в динамике, на разных стадиях их развития, включая самые ранние, когда эмбриоиды и каллусы находятся еще внутри гнезда пыльника.

Cледует отметить, что в литературе отсутствует периодизация развития андрогенных новообразований. Необходимость такой периодизации очевидна, накопленный фактический материал требует своего осмысления, в том числе и разработки общепринятой периодизации развития эмбриоидов злаков, аналогично периодизации развития зародышей (например, Батыгина, 1987). Что же касается периодизации развития каллусов, то этот вопрос, по-видимому, надолго останется открытым, поскольку каллус зачастую представляет собой гетерогенную систему групп клеток, возможно, различного происхождения, каждая из которых развивается по своим закономерностям.

В связи с отсутствием четкой периодизации развития андрогенных новообразований злаков мы предлагаем называть ранними те стадии развития эмбриоидов (каллусов), когда эти структуры находятся в гнезде пыльника, поздними - те стадии, когда структуры появляются на поверхности пыльника.

На рис. 1 представлена микрофотография механически разорванного пыльника пшеницы на 9 сут культивирования. Внутри пыльника среди популяции микроспор, находящихся в той или иной степени деградации, находятся эмбриоиды и каллусы на самых ранних стадиях их развития.

Эмбриоид (верхняя стрелка) уже на ранних этапах своего развития (4 клетки) представлен четко организованной структурой, характеризующейся регулярными клеточными делениями. В свою очередь, ранний каллус (нижняя стрелка) представлен достаточно беспорядочным скоплением клеток, точное количество которых указать трудно.

Эта тенденция сохраняется в ходе дальнейшего развития андрогенных новообразований.

Андрогенный эмбриоид на поздней стадии развития (25 сут. культивирования) представляет собой комплекс плотно упакованных клеток с четкими границами (рис. 2). Клетки полусферической формы, они значительно мельче, чем клетки каллуса, достаточно однородны по своей морфологии и не сморщены, в отличие от клеток каллуса. На рис. 3 показан участок андрогенного эмбриоида под большим увеличением (х 780). Стрелками указаны моменты деления клеток.

Андрогенный каллус на поздней стадии развития (30 сут. культивирования) характеризуется значительной гетерогенностью поверхности (рис. 6). Отмечается чередование участков аморфно расположенных клеток и клеток, плотно прилегающих друг к другу. Наблюдаются оболочки дегенерировавших микроспор. Кроме того, среди клеток каллуса обнаружены прорастающие пыльцевые трубки – уникальное, на наш взгляд, явление. На рис. 7 представлены пыльцевые трубки на более поздних стадиях развития. Интересному феномену формирования пыльцевых трубок внутри андрогенного каллуса пшеницы будет посвящена специальная статья авторов.

Вызывает интерес тот факт, что андрогенные каллусы формируют так называемые вторичные эмбриоиды. Такие каллусы и эмбриоиды также проанализированы методом СЭМ (рис. 7). Отчетливо различимы “родоначальный” каллус (маленькая стрелка) и вторичные эмбриоиды (большие стрелки), которые, как и первичные эмбриоиды (рис. 2), состоят из мелких однородных клеток с полусферической поверхностью.

Появление на андрогенных каллусах злаков вторичных эмбриоидов, морфологически сходных с первичными андрогенными эмбриоидами, описано в литературе, например у ячменя (Тивари, 1988). Детальный цитолого-гистологический анализ таких эмбриоидов пшеницы свидетельствует о том, что они берут начало от эпидермальных и субэпидермальных клеток каллуса (неопубликованные данные авторов).

Формирование вторичных эмбриоидов в культуре изолированных пыльников свидетельствует, по нашему времени, об исключительно высокой степени тотипотентности морфогенных микроспор в условиях in vitro: к морфогенезу оказываются способны структуры, сами полученные в культуральных условиях за счет свойства тотипотентности клеток изначальных структур.

Известно, что каллус характеризуется высокой морфогенетической лабильностью. По нашему мнению, это обусловлено наличием разнообразных клеток с разной способностью к морфогенезу. Благодаря наличию разветвленной сосудистой системы в каллусе создаются самые разные трофические и гормональные ситуации, и клетки могут быть индуцированы к различным путям морфогенеза.

Пользуясь случаем, авторы выражают искреннюю благодарность старшему научному сотруднику лаборатории эмбриологии БИН РАН (Санкт-Петербург) Г.Е.Титовой за большую помощь в разработке методики сканирования поверхности андрогенных новообразований пшеницы.

Список литературы

Абрамов С.Н., Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Ультраструктурный анализ клеток недифференцированного каллуса яровой мягкой пшеницы // Тез. докл. научн. конф. "Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов". Уфа: БНЦ УрО АН СССР, 1991. С. 76.

Абрамов С.Н., Круглова Н.Н. Ультраструктурный анализ клеток морфогенного каллуса пшеницы на ранних этапах развития // Труды междунар. конф. по анатомии и морфологии растений. СПб.: Диада, 1997, с. 338.

Батыгина Т.Б. Хлебное зерно. Л.: Наука, 1987. 103 с.

Батыгина Т.Б., Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Культура изолированных пыльников злаков с позиции экспериментальной эмбриологии растений. Уфа: БНЦ УрО РАН, 1992. 32 с.

Батыгина Т.Б., Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Андрогенез in vitro у злаков: анализ с эмбриологических позиций // Цитология. 1994. Т. 36. N 9-10. С. 993-1005.

Горбунова В.Ю. Генетические предпосылки спорофитного пути развитиямикроспор злаков в условиях in vitro. Уфа: УНЦ РАН, 1993. 104 с.

Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н. Методические аспекты культивирования изолированных пыльников пшеницы. Уфа: БНЦ УрО АН СССР, 1988. 20 с.

Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н., Батыгина Т.Б. Андрогенез в культуре изолированных пыльников злаков: цитолого-эмбриологические аспекты//Успехи соврем. биол. 1993. T. 113. N 1. C. 19-35.

Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н., Потапова Н.Н. Эмбриоидогенез в культуре пыльников пшеницы: цитолого-гистологические аспекты. Ч.I. Уфа: БНЦ УрО РАН, 1992. 63 с.

Ермаков И.П., Матвеева Н.П. Диморфизм пыльцы и андрогенез в культуре пыльников и микроспор//Вестн. Москов. ун-та. Сер. 16. 1986. N 3. C. 28-40.

Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Каллусогенез как путь морфогенеза в культуре изолированных пыльников злаков//Успехи совр. биол. 1997. Т. 117. Вып. 1. С. 83-94.

Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Цитолого-гистологический анализ эмбриоидов и каллусов пшеницы на ранних этапах развития // Труды междунар. конф. по анатомии и морфологии растений. СПб., 1997б. С.. 355-356.

Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю., Батыгина Т.Б. Эмбриоидогенез как путь морфогенеза в культуре изолированных пыльников злаков // Успехи совр. биол. 1995. Т. 115. Вып. 6. С. 692-703.

Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине. СПб.: Наука, 1994. 400 с.

Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г., Тихоненко Т.И., Прокофьев М.И. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. М.: Агропромзидат. 1990. 384 с.

Суханов В.М. Андроклиния и ее особенности у пшеницы: Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. Саратов: Саратовск. гос. ун-т,1983.22 с.

Тивари Ш. Пути развития микроспор в культуре пыльников ячменя. Алма-Ата, 1988. 20 с. Деп в КазНИИ науч.-технич. информации 24.02.88. № 2317-Ка88.

Шамина З.Б. Андрогенез и получение гаплоидов в культуре пыльников и микроспор//Культура клеток растений. М.: Наука, 1981. C. 124 - 136.

Barnabas B., Fransz P., Schel J. Ultrastructural studies on pollen embryogenesis in maize//Plant Cell Repts. 1987. V. 6. N 3. P. 212-218.

Chen C.C., Howarth M.J., Peterson R.L., Kasha K.J. Ultrastructure of androgenetic microspores of barley during the early stages of anther culture//Can. J. Genet. Cytol. 1984. V. 26. N 4. P. 484-491.

Dodds J.M., Reynolds T.L. A scanning electron microscope study of pollen embryogenesis in Hyosciamus niger L.//Z. Pflanzenphysiol. 1980. Bd. 97. H. 1. S. 271-276.

Galieva E.R., Gorbunova V.Yu., Kruglova N.N. Ultrastructure of spring wheat embryoid and callus cells//Proceed. XI Internat. Symp. "Embryology and seed reproduction". St.Petersburg, 1992. P. 292-293.

Guha S., Maheshwari S. In vitro production of embryos of Datura// Nature. 1964. V. 204. N 4957. P. 497.

Haggis G.H. Sample preparation for electron microscopy of internal cell structure//Microsc. Res. and Techn. 1992. V. 22. N 2. P. 151-159.

Heberle-Bors E. In vitro haploid formation from pollen: a critical review//Theor. Appl. Genet. 1985. V. 71. N 3. P. 361-374.

Higuchi N., Maeda E. Reobservation with light microscope of scanning electron microscopic speciments in rice callus cultures//Jap. Journ. Crop Sci. 1991. V. 60. N 2. P. 278-282.

Khan S.K., Sen O., Ghosh P.D. Scanning electron microscopic analysis during embryogenesis of Cicer arietium L. anthers in vitro//DAE Symp. Adv. Mol. Biol. Bombay, 1990. P. 411-412.

Langfold M., Taylor G.E., Flenley J.R. Computerized identification of pollen grains by texture analysis//Rev. Palacobot. and Palynol. 1990. V. 64. N 1-4. P. 197-203.

Maeda E., Chen M., Inoue M.>>>........//Biotechnology in agriculture and forestry. New York; Heidelberg; Berlin: Springer-Verlag, 1986. P. 105-.....

Sangwan R.S., Sangwan-Norreel B.S. Biochemical cytology of pollen embryogenesis//Intern. Rev. Cytol. 1987. V. 107. P. 221-272.

Schumann G. Zytologisch-histologische Untersuchungen in Triticale - Antherenkulturen//Arch. Zucht. 1987. Bd. 17. H. 1. S. 17-25.

Sunderland N., Dunwell J.M. Anther and pollen culture//Plant tissue and cell culture. Oxford: Blackwell, 1977. P. 223-265.

Takayama S., Azuma Y. Scanning electron microscopy of the centromeric region//CIS: Chromosomes Inf. Serv. 1995. N 59. P. 15-17.

Tanaka K. High resolution scanning electron microscopy of the ell//Biol. Cell.1989. V.65. N 2. P. 89-98.

Walther P., Hermann R., Wehrli E., Muller M. CryoSEM – an alternative to freeze fracture tem replicas? // biol. Cell. 1995. V. 84. N 3. P. 223-229.

Whelan E.D.P., Kokko E.G. Scanning electron microscopy of chromosomes of common wheat//Genome. 1992. V. 35. N 1. P. 166-169.