УДК 633.11:581.143.5:632.071

ИНДУКЦИЯ АНДРОГЕНЕЗА IN VITRO У ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ. БАЛАНС ЭКЗОГЕННЫХ И ЭНДОГЕННЫХ ФИТОГОРМОНОВ

© 2000 г. В.Ю.Горбунова, Н.Н.Круглова, С.Н.Абрамов

Институт биологии Уфимского научного центра РАН,

450054 Уфа, просп. Октября, 69

Дан анализ фитогормональных особенностей индукции андрогенеза in vitro в культивируемых пыльниках яровой мягкой пшеницы. Подчеркивается, что переключение программы развития микроспор с гаметофитного на спорофитный путь развития находится под контролем баланса экзогенных и эндогенных фитогормонов.

Метод культуры изолированных пыльников основан на использовании явления андрогенеза in vitro - процесса образования гаплоидного растения (спорофита) из микроспоры или клеток пыльцевого зерна (гаметофита высших растений)(Guha, Maheshwari, 1964). Различают прямой (регенерант возникает из микроспоры или клеток пыльцевого зерна через формирование зародышеподобной структуры - эмбриоида) и непрямой (регенерант берет начало от каллуса) андрогенез in vitro (Heberle-Bors, 1985; Sangwan, Sangwan-Norreel, 1987; Батыгина и др., 1992, 1994).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объектом исследования явилась коллекция сортов, гибридных форм и гибридов разных поколений яровой мягкой пшеницы, пыльники которых наиболее отзывчивы на условия культивирования in vitro.

Примененные фенотипические критерии развития растений (Куперман, 1962 и оригинальные разработки), способы фиксации (Бродский, 1966; Berlin, Miksche, 1976; Фурст, 1979), цитологические методики исследования (Ромейс, 1953; Прозина, 1960), модификация метода культуры пыльников (Горбунова, Круглова, 1988), периодизация фаз развития микроспор (Круглова, 1999; Круглова и др., 1991), методы статистической обработки данных изложены в статье В.Ю.Горбуновой, Н.Н.Кругловой (1997).

Определение концентрации фитогормонов в эксплантах проводили по методике иммуноферментного анализа, разработанной Г.Р.Кудояровой с соавторами (Кудоярова и др., 1986; Иммуноферментный анализ.., 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Индукция андрогенеза in vitro при культивировании изолированных пыльников, иначе говоря, индукция спорофитного пути развития микроспор или клеток пыльцевого зерна, приводящего к развитию эмбриоидов или каллусов, а далее - растений-регенерантов, зависит от многих взаимосвязанных факторов. Один из них - введение в состав культуральной среды определенных фитогормонов конкретной концентрации.

Как известно, фитогормоны - органические сравнительно низкомолекулярные соединения, с помощью которых осуществляется взаимодействие клеток, тканей и органов и которые в малых количествах необходимы для запуска и реализации физиологических программ (Полевой, 1982; Чайлахян, 1982; Дерфлинг, 1985). Впервые о введении фитогормонов (в частности, кинетина) в состав питательной среды и успешном получении эмбриоидов пыльцевого происхождения у Datura sp. сообщили первооткрыватели андрогенеза in vitro С.Гуха и С.Махешвари (Guha, Maheshwari, 1964). Впоследствии был накоплен достаточный эмпирический материал по изучению влияния различных фитогормонов на индукцию андрогенеза in vitro и регенерацию растений в культуре изолированных пыльников, хотя при этом получены зачастую противоречивые результаты. В целом, значение фитогормонального состава питательной среды для индукции и самого хода процесса андрогенеза in vitro в культивируемых пыльниках можно считать достоверно установленным (обобщения по этому вопросу см., например: Горбунова, 1993; Горбунова, Круглова, 1993, 1995; Gorbunova, Kruglova, 1994).

Мы решили проанализировать данную проблему с другой стороны выяснить роль генотипа в детерминации такого признака, как "уровень эндогенных фитогормонов".

Изучаемый набор генотипов пшеницы был исследован на содержание абсцизовой кислоты (АБК) и индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) в пыльниках на разных фазах микроспорогенеза. Особое внимание уделялось данным по эндогенному содержанию этих фитогормонов в пыльниках, содержащих микроспоры на оптимальной для индукции андрогенеза in vitro фазе развития (Горбунова, Круглова, 1997) - фазе сильновакуолизированной микроспоры. Установлено, что сорта и линии пшеницы значительно различаются по эндогенному уровню этих фитогормонов. Различия между вариантами достоверны и значимы (табл.1).

В целом, различия по содержанию ИУК в пыльниках между изученными генотипами менее значительны, чем по содержанию АБК.

Таблица 1. Эндогенное содержание фитогормонов в пыльниках различных генотипов яровой пшеницы в фазе сильновакуолизированной микроспоры

Таблица 2. Эндогенное содержание ИУК в вегетативных органах и в пыльниках различных генотипов яровой мягкой пшеницы

Примечание. r значимо на 1%-ном уровне.

Как свидетельствуют результаты исследования, расположение генотипов в порядке убывания ИУК во всех рядах, отражающих содержание ИУК в корешках, пыльниках и флаговых листьях, оказывается весьма сходным. Растения одной условной группы генотипов отличаются способностью к накоплению большего количества ИУК по сравнению с другой группой генотипов. Анализ тенденции одинаковой экспрессии данного признака в разных органах (корешки - листья - пыльники) и на разных стадиях развития растений (проросток - выход в трубку) позволил предположить, что различия по уровню эндогенной ИУК определяются их генотипом.

Интерпретация гормонального взаимодействия в экспланте и взаимная интерференция эндогенных и экзогенных фитогормонов до сих пор остается на уровне констатации феномена. Это объясняется тем, что один и тот же гормон оказывает множественное действие на объект, поэтому очень трудно связать воедино механизм его действия и клеточный ответ на него. Тем не менее, можно предложить следующий более или менее достоверный механизм этих процессов. У пятидневных проростков пшеницы наблюдается очень высокий гормональный фон, обусловленный ИУК. Причина этого в том, что в меристематической зоне корня (от чехлика до проводящей зоны) идут интенсивные митотические процессы, обусловливающие усиленный синтез ИУК, необходимый для инициации синтеза ДНК и прохождения части S-фазы клеточного цикла (Дмитриева и др., 1988). АБК при этом не является необходимым фактором для деления клеток, хотя известно, что этот фитогормон играет роль стимулятора репродуктивного развития растений (Чайлахян, 1982).

Приведенные ниже данные многолинейного корреляционного соотношения между цитологическим определением фаз микроспорогенеза (ЦИТ), фенотипическим подтверждением этой фазы (ФЕН) и содержанием фитогормонов в фазе невакуолизированной и в фазе сильновакуолизированной микроспоры служат подтверждением сказанному (табл. 3).

(Заметим в скобках, что однозначных выводов мы не делаем, потому что, как известно, даже одинаковые экспланты одного и того же генотипа не дают идентичного ответа в культуре клеток, тканей и органов, по всей вероятности, из-за изменчивости градиента уровня эндогенных гормонов. Поэтому факторостатирование условий и правило единственного различия в эксперименте при культивировании пыльников нами выдерживалось безукоснительно.)

Таблица 3. Корреляционные соотношения (r) между цитологическими, физиологическими и фенотипическими характеристиками микроспорогенеза in vivo

у некоторых генотипов яровой мягкой пшеницы

Как следует из табл. 3, на различных фазах микроспорогенеза между всеми приведенными признаками наблюдаются высокие и значимые корреляции. Исключение составляет корреляция эндогенного уровня АБК и фенотипически определяемой сильновакуолизированной фазой микроспорогенеза у растений пшеницы сорта Sonalika (r = -0.52), хотя это значение также достоверно и значимо. Поэтому, пользуясь предлагаемым нами способом, можно, не производя цитологического анализа, определять фазы микроспорогенеза. Такой подход эначительно облегчает и упрощает технологию культивирования пыльников пшеницы.

Согласно данным, приведенным в табл. 3, максимальное количество эндогенной ИУК приходится на пыльники, находящиеся на более ранних фазах микроспорогенеза (r= -0.87, = -0.99). Такое явление, на наш взгляд, можно легко объяснить значительными перестройками и множественными клеточными делениями в тканях стенки гнезда пыльника на ранних стадиях его развития. Высокий эндогенный уровень АБК в пыльниках, содержащих микроспоры поздней (сильновакуолизированной) фазы развития, можно объяснить деструктивными процессами в клетках тапетума и среднего слоя пыльника, что может обусловить освобождение АБК из митохондрий и хлоропластов этих слоев стенки гнезда пыльника.

Таблица 4.Корреляционные соотношения между эндогенным уровнем АБК и ИУК в пыльниках и концентрацией 2,4-Д в питательной среде

Таблица 5. Зависимость прямого и непрямого андрогенеза in vitro от концентрации 2,4-Д в питательной среде у различных генотипов яровой мягкой пшеницы

Согласно данным, приведенным в табл. 5, интенсивность прямого и непрямого андрогенеза in vitro у генотипов, характеризующихся высоким уровнем эндогенной ИУК (например, Sonalika), выше при низких концентрациях экзогенной 2,4-Д. Более того, в сортах этой группы были отмечены случаи индукции андрогенеза in vitro на безгормональной питательной среде, что свидетельствует о возможности экспланта с высоким уровнем эндогенных гормонов саморегулировать морфогенные процессы даже при отсутствии экзогенных стимуляторов. Наоборот, у генотипов, характеризующихся низким содержанием эндогенной ИУК (например, Саратовская 29), высокий уровень андрогенеза in vitro отмечен на питательной среде, более обогащенной 2,4-Д.

Таким образом, результаты исследований свидетельствуют о том, для успешного культивирования пыльников изученных генотипов пшеницы необходим строгий баланс между уровнем (количеством и качеством) эндогенных фитогормонов в пыльниках, содержащих микроспоры на оптимальной для индукции андрогенеза in vitro фазе развития, и количеством экзогенных фитогормонов, вносимых в состав питательной среды. Иными словами, воздействие экзогенных гормонов можно расценивать как триггер, который должен действовать "в нужный момент и в нужном месте". По всей вероятности, этот вывод можно отнести к культивированию пыльников не только пшеницы, но и любого растения.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант 99-04-48496) и ФЦП “Интеграция” (направление 5.1., проект № 32).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Батыгина Т.Б. Хлебное зерно. Л.: Наука, 1987. 103 с.

Батыгина Т.Б. Эмбриоидогения - новая категория способов размножения цветковых растений//Тр. Ботан. ин-та им. В.Л.Комарова. 1993. Вып. 8. С. 15-25.

Батыгина Т.Б., Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Культура изолированных пыльников злаков с позиции экспериментальной эмбриологии растений (методологические аспекты). Уфа: БНЦ УрО РАН, 1992. 32 с.

Батыгина Т.Б., Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Андрогенез in vitro у злаков: анализ с эмбриологических позиций//Цитология. 1994. Т. 36. N 9-10. С. 993-1005.

Биотехнология зерновых культур. Алма-Ата: Гылым, 1992. 240 с.

Бродский В.Я. Трофика клетки. М.: Наука, 1966. 354 с.

Горбунова В.Ю. Генетические предпосылки спорофитного пути развития микроспор злаков в условиях in vitro. Уфа: УНЦ РАН, 1993. 104 с.

Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н. Методические аспекты культивирования изолированных пыльников пшеницы. Уфа: БНЦ УрО АН СССР, 1988. 20 с.

Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н. Физиологические основы андрогенеза in vitro у злаков//Тез. докл. III съезда ВОФР. Ч. 1. Санкт-Петербург, 1993. С. 86.

Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н. Влияние генетической детерминации уровня эндогенных фитогормонов на выход андрогенных новообразовании у пшеницы//Генетика. 1994. Т. 30. Прилож. С. 34.

Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н. Физиологические аспекты андрогенеза in vitro у злаков//Тез. докл. III Российск. симп. Новые методы биотехнологии растений. Пущино, 1995. С. 18.

Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н. Индукция андрогенеза in vitro у яровой мягкой пшеницы. Оптимальная фаза микроспорогенеза//Изв. РАН. Сер. биол. 1997.

N 6. С. 668-676.

Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н., Батыгина Т.Б. Андрогенез в культуре изолированных пыльников злаков: цитолого-эмбриологические аспекты//Успехи соврем. биологии. 1993. Т. 113. Вып. 1. С. 19-35.

Дерфлинг К. Гормоны растений. Системный подход. М.: Мир, 1985. 304 с.

Дмитриева Н.Н., Винникова Н.В., Ермаков И.П., Матвеева Н.П. Ранняя реакция хроматина на ауксин у протопластов табака//Физиология растений. 1988. Т. 35. N 5. С. 879-887.

Дьячук П.А., Дьячук Т.И., Кудашкина С.В., Сафронова Н.Ф., Давыдов С.Д. Получение гаплоидных растений мягкой пшеницы саратовских сортов в культуре пыльников//Доклады ВАСХНИЛ. 1986. N 10. С. 3-10.

Иммуноферментный анализ регуляторов роста: применение в физиологии растений и экологии. Уфа: БНЦ УрО АН СССР, 1990. 132 с.

Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Каллусогенез как путь морфогенеза в культуре изолированных пыльников злаков//Успехи соврем. биологии. 1997. Т. 117. Вып. 1. С. 83-94.

Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю., Батыгина Т.Б. Периодизация развития пыльника злаков. Уфа: БНЦ УрО АН СССР, 1991. 8 с.

Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю., Батыгина Т.Б. Эмбриоидогенез как путь морфогенеза в культуре изолированных пыльников злаков//Успехи соврем. биологии. 1995. Т. 115. Вып. 6. С. 692-705.

Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Еркеев М.И. Иммуноферментное определение содержания индолилуксусной кислоты в семенах кукурузы с использованием меченых антител//Физиология растений. 1986. Т. 33. N 6. С. 1221-1227.

Куперман Ф.М. Теория индивидуального развития и пути управления природой организма. М.: Изд-во МГУ, 1962. 78 с.

Носова О.Н. Использование раствора 2,4-Д для повышения эффективности получения гаплоидов в культуре пыльников тритикале//Тез. докл. II Российск. симп. Новые методы биотехнологии растений. Пущино, 1993. С. 160.

Першина Л.А., Нумерова О.М., Белова Л.И., Девяткина Э.П., Шумный В.К. Особенности андрогенеза у мягкой пшеницы, межвидовых и межродовых гибридов//Сиб. биол. журн. 1993. Вып. 3. С. 3-9.

Полевой В.В. Фитогормоны. Л.: Изд-во Ленингр. ун-та. 1982. 248 с.

Приходько Н.И. Получение гаплоидов в культуре пыльников мягкой яровой пшеницы//Науч.-техн. бюлл. ВНИИ растениеводства. 1988. N 174. С. 51-59.

Прозина Н.И. Ботаническая микротехника. М.: Высш. шк., 1960. 206 с.

Рахимбаев И.Р., Тивари Ш., Кударов Б.Р. Экспериментальная гаплоидия в культуре пыльников и микроспор зерновых злаков (обзор)//С.-х. биол. 1990. N 3. С. 44-49.

Ромейс Б. Микроскопическая техника. М.: Иностр. лит., 1953. 718 с.

Тивари Ш., Рахимбаев И.Р. Действие 2,4-Д на морфогенез в культуре

пыльников и микроспор ячменя//Тез. докл. II Всесоюз. конф. Регуляторы роста и развития растений. Киев, 1989. С. 295.

Фурст Г.Г. Методы анатомо-гистохимического исследования растительных тканей. М.: Наука, 1979. 155 с.

Чайлахян М.Х. Гормональная регуляция роста и развития высших растений//Успехи соврем. биологии. 1982. Т. 95. Вып. 1. С. 23-34.

Barnabas B., Szakasz E., Kovacs G. Induction of haploid plants from wheat (Triticum aestivum L.) anther culture//Sver. Utsadesforen. Tidskr. 1989. V. 99. N 2. P. 115-123.

Batygina T.B. Problems of morphogenesis in situ, in vivo and in vitro//Proc. intern. sympos. "Plant tissue and cell culture: application to crop improvement". Prague: Czechosl. acad. sci. press, 1984. P. 43-49.

Batygina T.B. Position of the phenomenon of embryoidogeny in the system of flowering plant reproduction//Abstr. XI intern. sympos. "Embryology and seed reproduction". St.Petersburg: Nauka, 1992. P. 6-8.

Berlin G.P., Miksche G.P. Botanical microtechnique and cytochemistry. Yowa: State University press, 1976. 326 p.

Bregitzer Ph., Campbell R.D., Wu Y. Plant regeneration from barley callus: effects of 2,4-D and phenilacetic acid//Plant Cell, Tissue and Organ Cult. 1995. V. 43. N 3.

P. 229-235.

Bronsema F., Redig P., van Oostveen W., van Onckelen H., van Lammeren A. Uptake and biochemical analysis of 2,4-D in cultured zygotic embryos of Zea mays L.

//J. Plant Physiol. 1996. V. 149. N 3-4. P. 363-371.

Chuang Ch.-Ch., Quyang T.W. A set of potato media for wheat anther culture//Proc. sympos. on Plant Tissue Culture. Peking: Sci. Press, 1978. P. 51-56.

Foroughi-Wehr B., Zeller F. In vitro microspore reaction of different German wheat cultivars//Theor. and Appl. Genet. 1990. V. 79. N 1. P. 77-81.

Gorbunova V.Yu., Kruglova N.N. Androgenesis in vitro: physiological aspects of the phenomenon in cereals//Proc. XIII Intern. Congr. on Sexual Plant Reproduction. Vienna, 1994. P. 70.

Gorbunova V.Yu., Kruglova N.N. Genetical determination of the cereal androgenesis in vitro: hormonal aspects//Proc. XIV Intern. Congr. on Sexual Plant Reproduction. Lorne, 1996. P. 146.

Guha S., Maheshwari S. In vitro production of embryos from anther of Datura//Nature.

1964. V. 204. N 4957. P. 497.

Haploids of higher plants in vitro. Berlin et al.: Springer-Verlag, 1986. 203 p.

Heberle-Bors E. In vitro haploid formation from pollen: a critical review//Theor. and Appl. Genet. 1985. V. 71. N 3. P. 361-375.

Henry Y., Marcotte J.-L., de Buyser J. Nuclear gametophytic genes from chromosome arm 1RS improve regeneration of microspore-derived embryos//Genome. 1993. V. 36. N 5. P. 808-811.

Hu H. Wheat: improvement through anther culture//Biotechnology in agriculture and forestry. Berlin. 1986. P. 56-63.

Hu H., Huang B. Application of pollen-derived plants in crop improvement//Intern. Rev. Cytol. 1987. V. 107. P. 293-299.

Koinuma K., Mochizuki N., Inoue Y. Embryoid and callus induction and plant regeneration by anther culture of Japanese local varientles of maize (Zea mays L.)//Bull. Nat. Grassland Res. Inst. 1990. N 43. P. 13-22.

Liang G.H., Xu A., Hoang-Tang. Direct generation of wheat haploids via anther culture//Crop Sci. 1987. V. 27. N 2. P. 336-339.

Loschenberger F., Heberle-Bors E. Anther culture responsiveness of Austrian winter wheat (Triticum aestivum L.) cultivars//Bodenkultur. 1992. Bd. 43. H. 2. S. 115-121.

Maheshwari S., Tyagi A., Malhotra K., Sopory S. Induction of haploidy from pollen in Angiosperms - the current status//Theor. and Appl. Genet. 1980. V. 58. N 5. P. 193-205.

Moieni A., Sarrafi A. The effects of gibberellic acid, phenylethylamine, 2,4-D and genotype on androgenesis in hexaploid wheat (Triticum aestivum L.)//Cereal Res. Commun. 1996. V. 24. N 2. P. 139-145.

Ottaviano E., Mulcahy D. Gametophytic selection as a factor of crop plant evolution//Origin and domestical cultivated plants. Amsterdam, 1986. P. 101-134.

Rose Ju.B., Dunwell J.M., Sunderland N. Anther culture of Sorghum bicolor (L).

Maench. I. Effect of panicle pretreatment, anther incubatoin temperature and 2,4-D

concentration //Plant Cell Tissue Organ Culture.1986. V. 6. N 1. P. 15-22.

Sangwan R.S., Sangwan-Norrel B. Biochemical cytology on pollen embryogenesis//Intern. Rev. Cytol. 1987. V. 107. P. 221-264.

Shimada T., Otani M., Hatanaka H. Genetical factors of the anther culture response in Japanese winter cultivars//Bull. Res. Inst. Agr. Resour. 1993. N 3. P. 1-4.

.

УДК 633.11:581.143.5:632.071

V.Yu.Gorbunova, N.N.Kruglova, S.N.Abramov

INDUCTION OF ANDROGENESIS IN VITRO IN SPRING WHEAT.

THE BALANCE OF EXOGENOUS AND ENDOGENOUS PHYTOHORMONES

The analysis of phytohormonal features of induction of androgenesis in vitro in spring wheat anther culture has been given. It has been emphasized that the switch of the microsporial developmental programme from gametophytic pathway to sporophytic pathway is controlled by balance of exogenous and endogenous phytohormones.