УДК 633.11:581.143.5
Н.Н.Круглова, В.Ю.Горбунова, П.А.Куксо
МОРФОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ ПЫЛЬНИКОВ:
ВВЕДЕНИЕ
Процесс развития многоклеточных организмов из одной клетки остается одной из сложнейших проблем биологии. Фундаментальность вопроса о механизмах развития биологических объектов, т. е. о явлениях, лежащих в основе клеточной дифференцировки и клеточных взаимодействий в составе целостного организма, обусловливает огромный интерес к биологии развития [30]. Особенно важной представляется задача установления связей между процессами, контролирующими развитие на молекулярном, клеточном и организменном уровнях [16].
Морфогенез высших покрытосеменных растений трактуется как последовательная цепь изменений формы в онтогенезе, приводящая к созданию видоспецифичной структуры [14-16], совокупность протекающих в развивающемся организме процессов дифференцировки клеток с образованием специализированных тканей и органов [30]. Это процесс развития многоклеточных организмов из одной клетки, совершающийся на клеточном, тканевом и органном уровнях [4]. Есть достаточные основания для того, чтобы рассматривать морфогенез не только как самостоятельный в
онтогенетическом смысле уровень, но и как уровень, влияющий на более элементарные биологические процессы [11, 47]. Неудивительно поэтому, насколько разнообразны как теоретико-методологические подходы к изучению этого явления, так и предметная направленность конкретных исследований.Исследования в области морфогенеза растений приобрели в последнее время особую популярность. Это вызвано рядом причин. Во-первых, растительный морфогенез - весьма пластичный и обратимый процесс, что позволяет достаточно легко манипулировать развитием растения, изучать отдельные стадии развития независимо от других. Кроме того, активно развивающиеся в последнее время практические направления, использование достижений генной инженерии для создания новых форм растений требуют и более фундаментальных знаний и соответственно исследований в области биологии растений, в том числе изучения механизмов их развития [30].
Однако интенсивные исследования морфогенеза растений затруднены интегральным характером морфогенетических процессов, зависимостью их от многих внутренних и внешних факторов и их взаимодействий [15, 16].
Принципиально важное свойство морфогенеза - универсальность его путей как в условиях in vivo, так и в условиях in vitro [3-6, 55, 56]. Такая универсальность позволяет выбрать более простую, чем целый организм, модель для изучения особенностей морфогенетических процессов.
Великолепными моделями служат изолированные культуры органов, тканей и клеток, помещенные в контролируемые условия минерального питания, температуры, освещенности и экзогенных гормональных добавок. Растительные клетки способны in vitro в полной мере проявлять свой морфогенетический потенциал, вплоть до развития целого растения, причем контролируемые условия позволяют управлять этими процессами [6, 13-16, 37]
. Основанием для использования клеточной модели служит и важная роль клетки в процессах морфогенеза. В основе морфогенеза лежат темпы и ориентация клеточных делений, блокирование клеточного цикла, рост клеток и их дифференциация [16]. Кроме того, многие из растительных объектов хорошо изучены генетически, что позволяет использовать генетический подход для изучения их развития, в том числе в условиях in vitro (например [12]).Один из наиболее перспективных нетрадиционных подходов к изучению основных закономерностей и путей морфогенеза у растений in vitro метод культуры изолированных пыльников. Принципиально важно то, что для пыльника характерны основные морфогенетические процессы, свойственные растению в целом. С другой стороны, не смотря на то, что пыльник
- сложная интегрированная система, с методологической точкизрения это, несомненно, более простая модель для исследования процессов морфогенеза in vivo и in vitro, поэтому при изучении пыльника легче выявить и моделировать отдельные морфогенетические процессы и их корреляции [3, 4, 57, 58].
Метод культуры изолированных пыльников основан на использовании явления андрогенеза in vitro - процесса образования гаплоидного растения (спорофита) из микроспоры или клеток пыльцевого зерна (гаметофита высших растений). Различают прямой (регенерант возникает из микроспоры или клеток пыльцевого зерна через формирование зародышеподобной структуры - эмбриоида) и непрямой (регенерант берет начало от каллуса) андрогенез in vitro. Эмбриоиды и каллусы предложено называть андрогенными новообразованиями [7, 8, 23, 32, 34].
Данная статья - продолжение серии публикаций, посвященных изучению как процесса андрогенеза in vitro у злаков, так и метода культуры изолированных пыльников, основанного на использовании этого интереснейшего явления. Цель статьи - проанализировать роль классических фитогормонов в индукции и управлении морфогенетическими процессами в культуре изолированных пыльников (также главным образом на примере злаков).
Как известно, фитогормоны - органические сравнительно низкомолекулярные соединения, с помощью которых осуществляется взаимодействие клеток, тканей и органов и которые в малых количествах необходимы для запуска и реализации физиологических программ [26, 43]. Традиционно принято выделять пять групп классических фитогормонов: ауксины (производные индола, основной природный ауксин - гетероауксин; в эту группу также входят ИУК - индолилуксусная кислота, НУК нафтилуксусная кислота, 2,4-Д - дихлорфеноксиуксусная кислота), цитокинины (производные 6-аминопурина, основной природный цитокинин зеатин; особую популярность приобрел кинетин), гиббереллины (тетрациклические карбоновые кислоты класса дитерпеноидов, из них наиболее распространен гиббереллин А3, или гибберелловая кислота (ГК)), абсцизины (абсцизовая кислота (АБК
) - оптически активный сесквитерпеноид) и этилен (бесцветный газ, ненасыщенный углеводород с двойной связью) [43, 52]. Согласно данным последних лет, гормоноподобным регуляторным действием обладают и такие вещества, как олигосахариды, салициловая кислота, полиамины (по [30]). В качестве гормонов оцениваются брассиностероиды (химическая природа установлена для немногих из них - подробнее см. [28, 51] ), антезины, природа которых не установлена [52] и фузикокцин [40]. Cинтезированы и испытаны новые вещества с цитокининовым типом действия 4-фенил-тиоуреидо-салициловая кислота и 1-(3-хлорфенил)-3-(2-пиридил)мочевина [106].Действие фитогормонов в условиях in vivo и in situ изученo основательно. Достаточно вспомнить труды М.Х.Чайляхяна и представителей его научной школы (ИФР РАН), исследования сотрудников ИФР РАН, выполненные под руководством О.Н.Кулаевой и Р.Г.Бутенко, работы В.В.Полевого с коллегами (СПбГУ). Предлагаются новые методы выявления фитогормонов в растительных тканях, например иммуноферментный анализ
фитогормонов, разработанный С.Ю.Веселовым и Г.Р.Кудояровой (Институт биологии Уфимского НЦ РАН).Ауксины, гиббереллины, цитокинины, антезины оцениваются в целом
как гормоны стимулирующего действия, абсцизины и этилен ингибирующего действия. Постулировано общее свойство классических фитогормонов: синтезируясь в одних частях растения и транспортируясь в другие его части, они оказывают влияние на многие процессы, в том числе морфогенетического характера. Установлено, что между фитогормонами существуют многообразные связи. Действие всех фитогормонов на растение весьма поливалентно: все они действуют на рост и деление клеток, на процессы старения и адапатации, на транспорт веществ, дыхание, синтез нуклеиновых кислот и белков и на многие другие процессы. Показано
, что существенными факторами для эффективного действия гормонов являются, с одной стороны, концентрация гормона, достигшего специфических клеток-"мишеней" (см., например, работу [27], посвященную разработке высокоэффективной модельной системы для оценки взаимодействия цитокинина с его рецептором), с другой - компетентность растительной ткани.Однако у каждой группы фитогормонов имеются и свои специфические особенности воздействия на процесс морфогенеза растений. Так, ауксины (ИУК, НУК) - обязательные участники координации процессов морфогенеза, оказывающие влияние на деление, растяжение и дифференциацию клеток. Эти гормоны необходимы прежде всего для инициации репликации ДНК. Переход клеток к митозу и цитокинезу зависит, как правило, также и от присутствия цитокинина, однако высокие концентрации ауксина способны и без цитокинина вызывать митозы в соматических клетках растений. Таким образом, ИУК необходима для деления, роста и дифференциации клеток, т.е. процессов, которые лежат в основе морфогенеза. Наряду
с этим в действии ауксина на морфогенез проявляются и черты определенной специфичности (индукция корне- и ксилемообразования) [2, 43, 52].Самым типичным эффектом цитокининов, по которому проводится их
идентификация, является индукция митотической активности клеток. Деление, как правило, индуцируется не одним цитокинином, но сочетанием цитокинина и ауксина. По-видимому, начальные стадии процесса индуцируются ауксином, а затем необходимо присутствие обоих гормонов. В условиях in vivo цитокинины способствуют ветвлению, формированию почек, ускоряют прорастание семян, вызывают прерывание периода покоя спящих почек, семян и клубней [43, 52] и играют важную роль в формировании гинецея у цветка [46].
Абсцизовая кислота (АБК) обладает множественным физиологическим действием. Хорошо известно действие АБК как ингибитора роста растений, способствующего переходу растений в период покоя. Взаимоотношения АБК с ауксинами, гиббереллинами и цитокининами в регуляции роста еще не выяснены до конца. Во многих случаях АБК выступает антагонистом всех трех групп фитогормонов. Наряду с ингибирующим действием известны примеры и стимулирующего влияния АБК на рост растений [43, 52, 73].
В ходе изучения действия гиббереллина (гибберелловой кислоты (ГК)) на рост растений было установлено, что этот гормон стимулирует как деление клеток, так и их растяжение, однако деление клеток активируется в первую очередь. Характерный эффект ГК - ускорение деления клеток верхушечных меристем побега [43, 52]. Сообщается о важной роли ГК в формировании
андроцея в цветке [46].В результате многочисленных экспериментов в условиях in vivo и in situ было показано, что ключевым гормоном в системе регуляции морфогенеза у растений является ИУК, поскольку этот фитогормон перемещается по растению полярно и с наименьшей скоростью (0,7-1,5 мм/ч). Перемещение ИУК происходит в импульсном режиме, что усиливает ее индуцирующее действие и синхронизирует ростовые процессы. Развитие и рост корня регулируется в целом в растении притоком ИУК из верхушки побега, а формирование побега - притоком цитокинина из кончика корня. Эти два фитогормона составляют главный контур гормональной системы растений. Действие других фитогормонов накладывается на этот контур. В ходе онтогенеза происходит закономерная смена доминирующих центров и их взаимосвязей [43].
Эти наблюдения во многом подтверждаются многочисленными исследованиями морфогенеза in vitro.
Сделаны интересные попытки найти место каждого из фитогормонов в индукции и прохождении морфогенеза растений в условиях in vitro. Еще в 50-е годы Скуг и Миллер изучили влияние экзогенных фитогормонов на морфогенез в каллусной ткани, полученной из сердцевинной паренхимы стебля табака [98]. Предложенная ими ставшая классической концепция, согласно которой морфогенетические реакции тканей и
органов (образование корней, побегов, недифференцированный рост и т.п.) регулируются соотношением концентрации двух групп фитогормонов ауксинов и цитокининов, доминирует в области культивирования тканей и органов растений и до настоящего времени. Таким образом, переход клетки к организованному развитию рассматривается как результат изменения количественных соотношений между ауксинами и цитокининами [97].Альтернативная точка зрения на причины и физиологию процесса морфогенеза растений в культуре in vitro постулирует необходимость изолирования клетки от коррелятивных влияний организованной структуры. Истоки этого воззрения уходят к идеям Гебеля и Хаберландта, поддерживаются экспериментальными данными Стюарда и перекликаются со
взглядами Боннера (по [13]). Однако многие экспериментальные данные позволяют сомневаться в правильности этой точки зрения, т.е. существование клетки в изолированном состоянии далеко не достаточное и не обязательное условие перехода ее к развитию [13].
Однако и ставшая классической концепция Скуга-Миллера рядом авторов оценивается скорее как эмпирическая закономерность. Сайб и Карабаев [45], исходя из общей теории индивидуального развития организмов, предложили свою модель фитогормональной регуляции морфогенеза и регенерации растений. Как полагают авторы, для понимания онтогенеза необходимо ответить на вопрос: каким образом клеточная дифференцировка возникает во время индивидуально развития? Формирование структур (органов) может при этом рассматриваться как пространственная организация дифференцировки. Это процесс, по мнению исследователей, можно объяснить с помощью теории морфогенетических полей Чайлда, согласно которой вдоль развивающейся системы должен существовать градиент некоторых свойств (активности, метаболический, морфогенетического потенциала и т.п.). При этом апикальный или дистальный район системы, образующийся автономно или являющийся доминантным, вырабатывает поле (градиент свойств) определенной протяженности, которое контролирует все морфогенетические процессы в системе. По
-видимому, такая концепция имеет право на существование, однако требует экспериментальных подтверждений.В результате многочисленных экспериментов уставлено, что в культуре тканей и клеток растений можно наблюдать следующие процессы дифференцировки и морфогенеза, контролируемые фитогормонами [14]: 1. Дедифференцировка исходных специализированных или меристематических клеток изолированного из растения эксплантанта с превращением их в каллусные. Процесс связан со структурной перестройкой исходных клеток и с индукцией в них способности к последовательным делениям. Пролиферирующие каллусные клетки - основной тип культивируемых клеток растений. 2. Дифференцировка каллусных клеток, вышедших из цикла деления и специализирующихся на синтезе видоспецифических вторичных соединений. 3. Гистодифференцировка, в процессе которой каллусные клетки превращаются во флоэмные или ксилемные элементы. 4. Органогенез - образование зачатков корней или вегетативных и цветочных почек. 5. Соматический эмбриогенез - процесс, при котором каллусная клетка имитирует зиготу и дает начало биполярной эмбриоидной структуре.
Суммируя сказанное, можно прийти к заключению, что широкий спектр физиологической активности фитогормонов и достигнутые с их помощью большие успехи в реализации морфогенетического потенциала растительных клеток позволяют считать именно экзогенные фитогормоны основным фактором управления морфогенезом in vitro.
РОЛЬ КЛАССИЧЕСКИХ ФИТОГОРМОНОВ В РЕГУЛЯЦИИ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИХ
ПРОЦЕССОВ В КУЛЬТУРЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ ПЫЛЬНИКОВ
Индукция андрогенеза in vitro при культивировании изолированных пыльников, иначе говоря, индукция спорофитного пути развития микроспор или клеток пыльцевого зерна, приводящего к развитию эмбриоидов или каллусов, а далее - растений-регенерантов, зависит от многих взаимосвязанных факторов. Один из них - введение в состав культуральной среды определенных фитогормонов конкретной концентрации.
Впервые о введении фитогормонов (в частности, кинетина) в состав питательной среды и успешном получении эмбриоидов пыльцевого происхождения у Datura sp. сообщают первооткрыватели андрогенеза in vitro Гуха и Махешвари [74].
Важность дополнения минеральной среды фитогормонами для индукции андрогенеза in vitro в культивируемых пыльниках различных растений показана многими исследователями. Помимо использования общепринятых в практике культивирования клеток, тканей и органов сред МС [84, 54], Блейдза [59], B5 [66] были подобраны и испытаны среды специально для культивирования пыльников - N6 [62, 92, 95, 102] и варианты среды Potato [1
8, 24, 64].Накоплен достаточный эмпирический материал по изучению влияния различных фитогормонов на индукцию морфогенеза (эмбриоидогенеза и каллусогенеза) и регенерацию растений в культуре изолированных пыльников, хотя при этом получены противоречивые результаты. (Следует добавить в скобках, что зачастую исследователи при анализе событий, происходящих при культивировании пыльников, применяют термины "эмбриогенез" (эмбриологически правильнее - "эмбриоидогенез"), "зародыш" (эмбриологически правильнее - "эмбриоид"). В данной статье мы оставляем эти термины, обращая внимание читателя на их некорректность. Кроме того, не совсем верно употребляются названия фаз развития микроспор. Читателя, заинтересовавшегося современной периодизацией развития микроспор и пыльника, мы отсылаем к работам [4, 31, 33, 53]).
Многими исследователями изучена роль 2,4-Д – синтетического гормона ауксинового типа. Так, в результате изучения действия ауксина 2,4-Д на морфогенез в культуре пыльников ячменя было установлено, что количество образующихся каллусов увеличивалось по мере возрастания концентрации 2,4-Д в среде для индукции; однако увеличение концентрации 2,4-Д приводило к снижению веса каллусов [48]. Влияние концентрации экзогенного 2,4-Д на индукцию конкретного пути морфогенеза изучено и в культуре пыльников пшеницы: пониженные концентрации этого гормона стимулировали эмбриоидогенез, тогда как повышенные - каллусогенез [18, 24]. Количество образовавшихся каллусов в культуре пыльников сорго также зависело от концентрации 2,4-Д [94
]. O важной роли 2,4-Д в индукции андрогенеза in vitro у гексаплоидной пшеницы сообщается в работе [83]: исключение из среды этого гормона (при сохранении других гормонов) вело к отрицательной реакции на условия культивирования пыльников всех изученных генотипов. В то же время добавление к среде 2,4-Д при культивировании пыльников белены вело скорее к образованию недифференцированных каллусов, чем нормальных биполярных эмбриоидов; образования регенерантов достигали после переноса каллусов на среду без ауксина [65]. Введение 2,4-Д в виде раствора в стебель тритикале в фазе мейоза микроспороцитов и в фазе вакуолизированной микроспоры вело к значительному увеличению выхода андрогенных новообразований [42].При сравнении сред МС и N6 на примере культивирования пыльников риса в каждую из них для получения каллусов добавляли 2,4-Д, для регенерации растений из каллусов - кинетин и ИУК; показано, что среда N6 намного эффективнее для формирования каллусов, тогда как среда МС благоприятнее для регенерации растений [60
]. Наиболее подходящей средой для образования каллуса при культивировании пыльников риса (подвид japonica) оказалась среда МС с добавлением НУК и кинетина; для регенерации растений рекомендуется среда МС, дополненная НУК и кинетином вдвое меньшей концентрации [61]. В пыльниках красного каштана образовывались пыльцевые зародыши и растеньица при культивировании на среде МС, содержащей различные концентрации 2,4-Д и кинетина; при этом наибольшее количество эмбриогенных пыльников получили на среде с равными концентрациями ауксина и кинетина [87]. Для культивирования пыльников гексаплоидных тритикале использовали 7 питательных сред с добавлением 2,4-Д и кинетина к основной питательной среде N6; установлено, что морфогенез в значительной степени зависел от добавления фитогормонов: наиболее активный эмбриогенез отмечен на среде N6 с добавлением кинетина [95]. Введение ауксина или комбинации ауксина и кинетина в среду МС при культивировании пыльников ряда пасленовых (табака [101], дурмана [67, 85,], красавки [91]) также ведет к развитию части пыльцевых зерен в эмбриоиды. На пасленовых же детально изучена ответная реакция пыльников на каждый из вводимых в состав питательной среды цитокининов - кинетин, зеатин, зеатинрибозид; установлено, что только зеатинрибозид увеличивал продуктивность пыльников [90].Кроме сред МС и N6, исследователи используют для культивирования пыльников иные среды с иным составом фитогоромонов: модифицированную среду Гамборга, содержащую бензиламинопурин БАП, ИУК, НУК, кинетин и 2,4-Д [63], модифицированную среду В5, содержащую БАП и 2,4-Д [72], или среду В5 с добавлением НУК [86], среду 85D12 с добавлением одного из ауксинов и кинетина [75], а также среды без специальных названий, но тоже содержащие различные модификации гормональных добавок [25
, 107, 83; и мн. др.].Такие замены для ряда видов оказываются оправданными. Например, в работе, посвященной изучению роли фитогормонов в культуре пыльников ячменя, авторы сообщают о влиянии на частоту индукции новообразований и выход регенерантов не только модифицированного гормонального состава среды, но и гормональной предобработки колосьев донорных растений [25]. Однако, например, в культуре пыльников капусты добавление БАП к среде не оказало полезного влияния на образование зародышей; интересно, что зеленые регенеранты в этих экспериментах формировались главным образом на безгормональной среде [81]. Об отсутствии необходимости гормонов для индукции андрогенеза in vitro сообщается и в работах, посвященных культуре пыльников кукурузы [102], белены [88] и
перца [50]. Так, при культивировании пыльников белены на простой минеральной среде без регуляторов роста у небольшой части пыльцевых зерен начинаются митотические деления, ведущие к формированию эмбриоидов, которые внутри гнезда пыльника, до выхода на верхность в виде проростков, повторяют нормальные стадии развития зиготических зародышей. Не требовались гормоны и в случае образования вторичных эмбриоидов из первичных эмбриоидов, полученных в культуре пыльников рапса; однако побеги на вторичных эмбриоидах начинали образовываться после переноса их на питательные среды с добавлением кинетина или кинетина и ИУК [82].В то же время при культивировании пыльников кукурузы японских сортов исследователи не наблюдали существенных различий в процессах эмбриоидо- и каллусогенеза при использовании сред с различным гормональным составом [76].
При культивировании пыльников ряда растений предложено использовать нетрадиционные в культуре тканей и клеток фитогормоны: этилен (этот гормон в культуре пыльников Solanum carolinense L. сам по себе не индуцировал каллусогенез, но в смеси с ауксином снижал процент каллусогенеза) [93], ауксин ФУК - фенилуксусную кислоту (изучая влияние ФУК на регенерацию растений в культуре пыльников пшеницы и ячменя, исследователи установили, что этот ауксин незначительно увеличивал выход зародышей, но заметно снижал количество альбиносов среди регенерантов [109]; однако на тех же объектах другие исследователи не выявили индуцирующей андрогенез in vitro роли ФУК [77]). Показано значительное повышение эффективности регенерации растений из каллусов пыльцевого происхождения у пшеницы при добавлении в среду практически не используемой в культуре тканей ГК вместо традиционно используемых НУК и кинетина [108]. Однако в работе [83] сообщается об уменьшении количества образовавшихся эмбриоидов и зеленых регенерантов (при увеличении количества альбиносных регенерантов) в культуре пыльников гексаплоидной пшеницы при введении в состав среды ГК.
Установлено комплексное воздействие фитогормонов на индукцию морфогенеза в культуре пыльников in vitro. Так, при совместном применении 2,4-Д и зеатинрибозида в культуре пыльников ячменя наблюдалось значительное увеличение образования каллуса; добавление в среду только 2,4-Д немного увеличивало частоту образования каллуса,
тогда как применение только зеатинрибозида в невысоких концентрациях не влияло на этот процесс, а в высоких - подавляло образование каллуса [105]. У этого же объекта усиление индукции каллусогенеза и регенерации зеленых растений в культуре пыльников достигалось применением ГК совместно с бензидазолом [25]. Увеличение количества образовавшихся эмбриоидов и зеленых регенерантов при совместном введении в состав среды 2,4-Д и ГК отмечено и в культуре пыльников гексаплоидной пшеницы [83]. Тем не менее в работе [100], посвященной именно вопросу изучения одиночного и комплексного действия фитогормонов (ауксинов, гиббереллинов, цитокининов) на развитие пыльцевых эмбриоидов Datura innoxia, сделан вывод о том, что комбинация гормонов не ведет к увеличению ответной реакции пыльников на условия культивирования по сравнению с применением этих гормонов в отдельности.Ряд исследователей [9, 18] изучали такой тонкий момент, как взаимовлияние экзогенных гормонов питательной среды (2,4-Д и АБК) и эндогенных гормонов экспланта (АБК и ИУК) в динамике культивирования пыльников яровой мягкой пшеницы. Используя метод линейной корреляции, авторы установили, что при культивировании пыльников на полной питательной среде с добавлением обоих гормонов взаимовлияния как экзогенных, так и эндогенных гормонов не отмечалось; наиболее полное взаимовлияние эндогенных фитогормонов наблюдали при использовании среды без экзогенных гормональных добавок. Хорошо изучена определяющая роль генотипа в реализации андрогенетических способностей пыльника
in vitro. Многие исследователи указывают на то, что разные генотипы дают различный выход регенерантов при культивировании пыльников на изучаемой среде (например [18, 24, 49, 76, 79] и мн. др.).Для получения растений-регенерантов цветной капусты пыльники 11 гибридных сортов культивировали на основной среде В5 с добавлением НУК; показано, что генотипы отличались значительно в отношении выхода зародышей [86]. Только от генотипа зависела и частота регенерации зеленых растений в культуре пыльников пшеницы, состав среды на этот показатель не влиял [96]. Более того, известны публикации, в которых указывается на неотзывчивость пыльников некоторых сортов злаков на всех испытанных средах и во всех изученных вариантах (например [18, 20, 76]).
Показано, что один и тот же гормон может оказывать различное действие в культуре пыльников различных генотипов одного растения. Например, АБК в низких концентрациях стимулировала образование эмбриоидов у одних изученных сортов пшеницы и подавляла у других [96].
На примере культуры пыльников двух генотипов пшеницы изучалось эндогенное содержание ИУК в эксплантах после различных видов предобработок колосьев донорных растений. Оценивались длительность воздействия низкой положительной температурой и способ стерилизации; учитывалось и время, прошедшее от момента стерилизации колосьев до инокуляции пыльников на питательную среду. Интересно, что у изученных сортов отмечены аналогичные изменения в эндогенном содержании ИУК [10].
Таким образом, тот факт, что генотип донорного растения - основной фактор, детерминирующий переключение гаметофитной программы на спорофитную, общеизвестен; отмечена значительная генетическая вариабельность ответа пыльника различных сортов и гибридных линий на условия культивирования in vitro. Однако исследователи зачастую только констатируют этот факт. Выбор оптимальной концентрации экзогенных гормонов при культивировании пыльников носит главным образом случайный характер. Перспективное направление исследований - анализ физиологической основы генетической вариабельности отзывчивости пыльников на условия культуры. В течение ряда лет Горбуновой с соавторами [19, 21, 68-71] ведется поиск надежного критерия прогнозирования этого параметра на основании физиологических (а именно, эндогенно гормональных) показателей экспланта. Гипотеза исследователей состоит в том, что ответ культивируемого пыльника на действие экзогенных гормонов детерминирован уровнем (количеством и качеством) эндогенных гормонов в пыльнике. Перспективные сорта яровой мягкой пшеницы, ржи и тритикале изучались с целью проверки этой гипотезы на примере действия экзогенной 2,4-Д и эндогенной АБК с применением метода иммуноферментного анализа фитогормонов. Установлено, что различный гормональный статус пыльников изученных сортов обусловливает тщательный выбор доз экзогенной 2,4-Д в культуральной среде. Например, сорта яровой мягкой пшеницы (Sonalika, Скала), характеризующиеся высоким уровнем содержания эндогенной АБК, требовали небольшой концентрации 2,4-Д в среде, тогда как сорта с низким уровнем АБК (Линия 35, Саратовская 29), напротив, нуждались в большем количестве этого экзогенного гормона. Этот вывод подтвержден исследователями цитологическим анализом процесса андрогенеза in vitro в пыльниках различных генотипов пшеницы при воздействии 2,4-Д различных
концентраций [35]. Так, воздействие на высокоауксиновые пыльники высокой концентрацией ауксинового экзогенного гормона (1,5-2 мг/л) вызывает усиленную пролиферацию микроспор, а затем каллусогенез. В микроспорах этих же сортов, инокулированных на среды с низким (0,1-0,25 мг/л) содержанием 2,4-Д и на безгормональные среды, наблюдается множество митотических делений, ведущих к формированию сначала многоклеточных структур, а затем - эмбриоидов. Таким образом, экспланты с высоким уровнем эндогенных ИУК и АБК способны саморегулировать морфогенные процессы даже при отсутствии экзогенных стимуляторов. В целом показана возможность регуляции процесса культивирования пыльников пшеницы адекватными измененениями содержания экзогенных гормонов.Конкретизируя эти исследования, Круглова с соавторами [36] изучали действие экзогенного гормона 2,4-Д различных концентраций (0,25; 0,5; 1,0 мг/л) на цитологические процессы в культивируемых пыльниках пшеницы модельного сорта пшеницы - Sonalika, характеризующегося высоким уровнем выхода эмбриоидов. Данные светооптического анализа свидетельствуют о том, что при культивировании пыльников с использованием сред всех вариантов наблюдается дегенерация абсолютного большинства микроспор уже к концу 3 сут эксперимента; при этом отмечена дегенерация связника и тканей стенки гнезда пыльников. При использовании среды с концентрацией 2,4-Д в 0,5 мг/л часть микроспор останавливается в своем развитиии на стадии, соответствующей стадии развития в момент инокуляции; связники и ткани стенки гнезда пыльников постепенно дегенерируют. Незначительная часть популяции микроспор при использовании варианта среды с концентрацией 2,4-Д в 1,0 мг/л продолжает обычный ход микрогаметогенеза до стадии 2-клеточного и даже 3-клеточного пыльцевого зерна; связники и ткани стенки гнезда пыльников сохраняют свою архитектонику. При использовании варианта среды с концентрацией 2,4-Д в 0,25 мг/л часть микроспор подвергается дополнительным равным делениям, что ведет к формированию многоклеточных структур, которые в дальнейшем дают начало эмбриоидам. Таким образом, входящий в состав питательной среды гормон 2,4-Д в концентрации 0,25 мг/л способствует инициации дополнительных равных делений микроспор в пыльниках пшеницы изученного сорта, тем самым оказывая воздействие на развитие
микроспор по нетрадиционному спорофитному пути. Авторы высказывают предположение о возможности регуляции эмбриоидогенеза в культуре пыльников пшеницы путем подбора оптимальной для каждого сорта концентрации 2,4-Д в составе питательной среды.Еще один важный фактор, влияющий на индукцию андрогенеза in vitro - благоприятная фаза развития микроспор и пыльцевых зерен (и, естественно, благоприятный период развития пыльника в целом) в момент инокуляции пыльников на/в питательные среды [22, 78, 87, 93 и мн. др.]
. Микроспоры и пыльцевые зерна реагируют на условия культивирования только в пределах ограниченного промежутка времени.К настоящему времени исследователи не пришли к единому мнению о фазе развития микроспор и пыльцевых зерен, наиболее адекватной для начала культивирования пыльников. Для злаков в качестве оптимальной для индукции андрогенеза in vitro наиболее часто в литературе [18, 22, 24, 75, 95 и др.] указывается поздняя фаза микроспорогенеза (эмбриологически правильнее - фаза сильновакуолизированной микроспоры. - Авт.)
Однако количество исследований, посвященных влиянию экзогенных фитогормонов определенной концентрации на пыльники, содержащие микроспоры/пыльцевые зерна той или иной фазы развития, достаточно ограничено. Например, на примере томатов было показано, что высокие концентрации фитогормонов в среде при инокуляции пыльников, содержащих микроспоры в фазе мейоза, усиливали каллусогенез, в фазе одноядерных микроспор (эмбриологически правильнее - в фазе вакуолизированных микроспор. - Авт.) - эмбриоидогенез. Таким образом, авторы обнаружили фазоспецифичное действие фитогормонов на процессы, происходящие в культивируемых пыльниках, установили, что если направление процесса клеточных дифференцировок зависит от фазы развития, то его темп определяется гормональными факторами, причем стимулируется доминирующий процесс [41]. В работе Рагхавана [89] пыльники белены разных стадий развития культивировали на среде из минеральных солей и сахарозы с добавлением ауксина 2,4-Д. Установлено, что добавление 2,4-Д усиливало эффективность культивирования пыльников, но не влияло на количество эмбриогенных пыльцевых зерен, дававших начало каллусу. Однако автор не сообщает о влиянии стадии развития пыльника (и, соотвественно, фазы развития пыльцевого зерна) белены на индукцию каллусогенеза.
На наш взгляд, было бы чрезвычайно интересно изучить зависимость между фазой развития микроспор/пыльцевого зерна, фитогормональным составом среды и фитогормональным статусом пыльника. Такого рода исследования достаточно ограничены, во-первых, в силу методических трудностей количественного определения фитогормонов, во-вторых, в связи с интегральным характером морфогенетических процессов, их зависимостью от многих внешних и внутренних факторов.
Этот сложный вопрос, по-видимому, следует решать поэтапно, начав с изучения фитогормонального статуса пыльников на разных стадиях развития. Единичные исследования такого рода известны. Так, в работе [18] на примере ряда злаков сообщается о результатах изучения корреляционных отношений между цитологическим определением фаз микроспорогенеза, фенотипическим подтверждением этой фазы и содержанием фитогормонов на ранней и поздней фазах микроспорогенеза. Между всеми этими признаками наблюдаются высокие и значимые корреляции. Показано, например, что у пшеницы более ранние фазы микроспорогенеза характеризуются большим содержанием в пыльниках ИУК; автор объясняет это наблюдение множественными делениями в тканях стенки гнезда пыльника на ранних этапах его развития. Высокий уровень АБК в поздних микроспорах, по мнению исследователя, обусловлен как началом генеративного пути развития микроспор, так и деструктивными процессами в тапетуме и среднем слое, что ведет к освобождению АБК из митохондрий и хлоропластов этих слоев стенки гнезда пыльника.
Данные, полученные при культивировании целых пыльников, некоторые исследователи сравнивают с данными, полученными при культивировании изолированных микроспор или пыльцевых зерен. Например, для сравнения эмбриогенной способности культур микроспор и пыльников у капусты были использованы различные фитогормоны; установлено, что в целом по образованию зародышей культура микроспор оказалась в 10 раз эффективнее культуры пыльников [99]. Однако в целом, несмотря на эффективность, метод культуры изолированных микроспор/пыльцевых зерен
не получил большого распространения, по-видимому, в силу своей трудоемкости и частых неудач. Высказано предположение, что неудачи при культивировании микроспориальных или пыльцевых культур обусловлены несовершенством методов, а не с отсутствием генов, детерминирующих способность к пролиферации in vitro [80].В последнее время в литературе появились интересные публикации, посвященные молекулярно-биологическим аспектам культивирования пыльников и зависимости их от фитогормонов. Например, в работе [103] сообщается об изучении влияния АБК на регуляцию экспрессии генов запасных белков в эмбриоидах рапса, полученных из микроспор. Реакция на АБК была стадиеспецифичной: максимальные уровни мРНК для запасных белков наблюдались на стадии торпедо. Обработанные АБК эмбриоиды накапливали гормон очень быстро, максимальная концентрация АБК отмечена через 24 ч, но через 72 ч концентрация АБК понизилась до исходных уровней.
Таким образом, зависимость морфогенеза в культуре изолированных пыльников от фитогормонального состава среды и фитогормональных особенностей экспланта можно считать достоверно установленной.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В последние годы накоплен огромный фактический материл о действии фитогормонов на разных этапах культуры изолированных клеток, тканей и органов, в том числе пыльников. Сделаны важные обобщения, позволяющие приблизиться к пониманию физиологических и цитолого-гистологических особенностей процесса морфогенеза in vitro.
Однако нерешенных проблем еще немало. Например, в недостаточной степени изучены молекулярные механизмы действия фитогормонов. Выделение гормонсвязывающих белков, поиск гормональных рецепторов первые шаги в изучении начальных этапов гормонального действия. Наибольший процесс достигнут в этой области в исследовании действия ауксинов, для которых
были выделены и охарактеризованы ауксинсвязывающие белки, являющиеся, как считается, истинными первичными рецепторами ауксина в растительной клетке; показано, что ряд известных мутаций по чувствительности к ауксину (например, мутация diageotropica у томата) связан с изменениями в спектре ауксинсвязывающих белков; подобные связывающие белки находятся в стадии интенсивного изучения и для других гормонов (по [30]). Для ауксинов же показано их участие в регуляции экспресии генов бактерий и растений [29].Несомненно, что в процессе перепрограммирования клеток и детерминации их к морфогенезу важную роль должны играть процессы перестройки цитоскелета, которому в настоящее время придают большое значение, не исключая даже функцию рецепции и передачи информации между клетками [38].
При морфогенезе in vivo экспрессируются гены, кодирующие белки, связанные с определенными этапами развития зародыша. Важная роль фитогормонов в этом процессе очевидна (например [39]. Это положение начинает получать экспериментальную поддержку: на примере кукурузы проведен анализ множественных классов генов, реагирующих на АБК в процессе эмбриогенеза [104]. Было бы чрезвычайно интересно изучить этот вопрос при морфогенезе в культуре изолированных пыльников.
Многое остается неясным и в процессах детерминации развития микроспор по спорофитному пути. Такие понятия, как сигналы и индукторы, их природа и специфичность, приобретение и потеря компетентности клетками не имеют пока точных характеристик. Предполагается участие внеклеточных гаметофитных белков в регуляции морфогенеза микроспор in vitro [1].
Еще одно перспективное, на наш взгляд, направление дальнейших исследований - изучение иммунолокализации фитогормонов в микроспорах культивируемых пыльников как в момент инокуляции их на питательную среду, так и в процессе морфогенеза и регенерации растений. Использование специфических антител к гормонам при морфогенезе in vitro в культуре изолированных пыльников позволит по динамике их изменения прогнозировать пути морфогенеза. Кроме того, иммунохимический подход, основанный на фило- и онтогенетической оценке специфичности антигенных детерминант, открывает возможность решать в единой концепции биологического узнавания как фундаментальные, так и прикладные проблемы физиологии растений, биохимии, генетики, селекции, а это в свою очередь создает основу для развития соответствующих направлений фитоиммунобиотехнологии [17].
Разрабатывается и такое интересное направление, как исследование кинетики роста и динамики гормональных градиентов на модельных многоклеточных структурах растительного типа - компьютерных растениях [44].
Можно надеяться, что новые идеи и применение все более совершенных аналитических методов помогут исследователям ответить на вопросы, которые пока не имеют ответа.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант N 99-04-48496).
.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Андреюк Д.С., Матвеева Н.П., Ермаков И.П. Внеклеточные белки, индуцирующие спорофитный морфогенез в культуре изолированных микроспор табака//Тез. докл. VII междунар. конф. "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда". М., 1997. С. 69.
2. Араратян Л.А. Цитогенетические эффекты фитогормонов. Ереван: АН Арм.ССР, 1989. 137 с.
3. Батыгина Т.Б. Пыльник как модель изучения морфогенетических
потенций и путей морфогенеза//Тез. докл. Всесоюз. симп. "Развитие мужской генеративной сферы растений (морфо-физиологические аспекты)". Симферополь, 1983. С. 9-10.
4. Батыгина Т.Б. Хлебное зерно. Л.: Наука, 1987. 103 с.
5. Батыгина Т.Б. Эмбриоидогения - новая категория способов
размножения цветковых растений//Тр. Ботан. ин-та им. В.Л.Комарова. Вып. 8. СПб., 1993. С. 15-25.
6. Батыгина Т.Б., Васильева В.Е., Маметьева Т.Б.Проблемы
морфогенеза in vivo и in vitro (эмбриоидогенез у покрытосеменных)//Ботан. журн. 1978. Т. 63. N 1. C. 87-1
11.7. Батыгина Т.Б., Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Культура изоли-
рованных пыльников злаков с позиции экспериментальной эмбриологии растений (методологические аспекты). Уфа: БНЦ УрО РАН, 1992. 32 с.
8. Батыгина Т.Б., Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Андрогенез in
vitro у злаков: анализ с эмбриологических позиций//Цитология. 1994. Т. 36. N 9-10. С. 993-1005.
9. Башаркина Н.В. Взаимовлияние гормонов питательной среды и
гормонов экспланта в культуре пыльников яровой мягкой пшеницы//Тез. докл. III съезда ВОФР. Ч. 1. СПб., 1993. С. 66.
10. Башаркина Н.В., Надольская С.Н. Влияние предобработок на эн-
догенное содержание 3-индолилуксусной кислоты при культивировании пыльников яровой мягкой пшеницы //Тез. докл. III съезда ВОФР. Ч. 1. СПб., 1993. С. 67.
11. Белоусов Л.В. Биологический морфогенез. М.: Изд-во Московск.
ун-та, 1987. 238 с.
12. Бузовкина И.С., Смирнова О.А. Использование методов in vitro
для выявления признаков морфогенеза у линий и гибридов редиса//Генетика. 1994. Т. 30. Прилож. С. 19.
- 19 -
13.
Бутенко Р.Г. Дифференциация и морфогенез в культуре тканей,клеток и протопластов//Биология развития растений. М.: Наука, 1975. С. 48-65.
14. Бутенко Р.Г. Индукция морфогенеза в культуре тканей расте-
ний//Гормональная регуляция онтогенеза растений. М., 1984. С. 42-54.
15. Бутенко Р.Г. Состояние и перспективы изучения морфогенеза
растений//Всесоюз. об-во физиологов раст. 1990. Вып. 8. С. 5-8.
16. Бутенко Р.Г. Клеточные и молекулярные аспекты морфогенеза
растений in vitro//I Чайляхян. чтение. Пущино: Пущинский НЦ, 1994. С. 7-26.
17. Володарский А.Д. Системный иммунохимический подход в изуче-
нии клеточных антигенов - основа фитоиммунобиотехнологии//Тез. науч.-метод. совещ. "Методы комплексной оценки продуктивности и устойчивости сельскохозяйственных растений". М., 1994. С. 4.
18. Горбунова В.Ю. Генетические предпосылки спорофитного пути
развития микроспор злаков в условиях in vitro. Уфа: УНЦ РАН, 1993. 104 с.
19. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н. Физиологические основы андро-
генеза in vitro у злаков//Тез. докл. III съезда ВОФР. Ч. 1. Санкт-Петербург, 1993. С. 86.
20. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н. Влияние генетической детерминации уровня эндогенных фитогормонов на выход андрогенных новообразовании у пшеницы//Генетика, 1994, т. 30, прилож. с. 34.
21. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н. Физиологические аспекты андро-
генеза n vitro у злаков//Тез. докл. III Российск. симп. "Новые методы биотехнологии растений". Пущино, 1995. С. 18.
22. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н. Индукция андрогенеза in vitro
у яровой мягкой пшеницы. Оптимальная фаза микроспорогенеза//Известия РАН. Серия биол. 1997. N 6. С. 668-676.
23. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н., Батыгина Т.Б. Андрогенез в культуре изолированных пыльников злаков: цитолого-эмбриологические аспекты//Успехи соврем.биологии. 1993, т. 113, N 1. С. 19-35.
24. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н., Потапова Н.Н. Эмбриоидогенез
в культуре пыльников пшеницы: цитолого-гистологические аспекты. Ч. 1. Уфа: БНЦ УрО РАН, 1992. 64 с.
25. Гурецкая В.С. Роль биологически активных соединений в индук-
ции гаплоидов в культуре пыльников//Тез. докл. междунар. конф. "Молекулярная генетика и биотехнология". Минск, 1998. С. 170-171.
- 20 -
26. Дерфлинг К. Гормоны растений. Системный подход. М.: Мир,
1985. 304 с.
27. Земляченко Я.В., Каравайко Н.Н., Маслова Г.Г., Кулаева О.Н.
Новый подход к изучению зависимости между структурой и функцией цитокининов//Докл. РАН. 1997. Т. 353. N 2. P. 261-263.
28. Зубарев А.В. Влияние эпибрассинолида на каллусогенез Nicoti-
ana tabacum//Тез. докл. междунар. конф. "Молекулярная генетика и биотехнология". Минск, 1998. С. 179.
29. Кацы Е.И. Участие ауксинов в регуляции экспрессии генов бак-
терий и растений//Генетика. 1997. Т. 33. N 5. C. 565-576.
30. Коваленко О.В. Генетические аспекты морфогенеза расте-
ний//Успехи соврем. биологии. 1993. Т. 113. Вып. 3. С. 269-285.
31. Круглова Н.Н. Периодизация развития пыльника злаков как
методологический аспект изучения андрогенеза in vitro//Известия РАН. В печати.
32. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Каллусогенез как путь морфоге-
неза в культуре изолированных пыльников злаков//Успехи совр.биол. 1997, т. 117, вып. 1, с. 83-94.
33. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю., Батыгина Т.Б. Периодизация
развития пыльника злаков. Уфа: БНЦ УрО АН СССР, 1991. 8 с.
34. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю., Батыгина Т.Б. Эмбриоидогенез
как путь морфогенеза в культуре изолированных пыльников злаков// Успехи совр. биол. 1995, т. 115, вып. 6, с. 692-705.
35. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю., Потапова Н.Н. Цитологическая
характеристика культивируемых пыльников яровой пшеницы при различных концентрациях 2,4-Д в составе питательной среды//Тез. докл. Всесоюзн. конф. "Экологическая генетика растений, животных, человека." Кишинев: Штиинца, 1991, с. 418.
36. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю., Потапова Н.Н. Влияние кон-
центрации 2,4-Д на начальные этапы эмбриоидогенеза в культуре пыльников яровой пшеницы//Тез. докл. III съезда ВОФР. Ч. 2. Санкт-Петербург, 1993. С. 139.
37. Марченко А.О. Реализация морфогенетического потенциала рас-
тительных организмов//Успехи соврем. биологии. 1996. Т. 116. N 3. С. 306-319.
38. Медведев С.С. Физиологические основы полярности растений.
СПб.: Кольна, 1996. 159 с.
39. Мертвецов Н.П. Гормональная регуляция экспрессии генов. М.:
- 21 -
Наука, 1986. 207 с.
40. Муромцев Г.С. Фузикокцин - новый фитогормон?//Физиол. раст.
1996. Т. 43. N 3. С. 478-492.
41. Нгуен Хонг Минь, Смирнов В.А., Балашова Н.Н. Генетические
различия по потребности к фитогормонам//Изв. АН Республики Молдова. Биол. и хим. науки. 1991. N 5. C. 13-20.
42. Носова О.Н. Использование раствора 2,4-Д для повышения эф-
фективности получения гаплоидов в культуре пыльников тритикале//Тез. докл. II Российск. симп. "Новые методы биотехнологии растений". Пущино, 1993. С. 160.
43. Полевой В.В. Фитогормоны. Л.: Изд-во Ленингр. ун-та. 1982.
248
с.44. Романов Г.А., Суховеров С.С. Использование кинетики роста и
динамики гормональных градиентов на модельных структурах растительного типа - компьютерных растениях//Докл. РАН. 1997. Т. 352. N 6.
С. 845-848.
45. Сайб Л.Р., Карабаев М.К. Фитогормональная регуляция регене-
рации растений: качественная модель//Изв. АН КазССР. Серия биол. 1991. N 3. С. 15-22.
46. Сидорский А.Г. Влияние фитогормонов на работу супергена цветка покрытосеменных растений//Генетика. 1994. Т. 30. Прилож. С. 144.
47. Теоретические и математические аспекты морфогенеза. М.: Наука, 1987. 295 с.
48. Тивари Ш., Рахимбаев И.Р. Действие 2,4-Д на морфогенез в культуре пыльников и микроспор ячменя//Тез. докл. II Всесоюзн. конф. "Регуляторы роста и развития растений". Киев, 1989, с. 295.
49
. Тураев А.М., Шамина З.Б. Оптимизация состава среды для культивирования пыльников хлопчатника//Физиол. раст., 1986, т . 33, N 3, с. 565-571.50. Тюкавин Г.Б. Получение константной линии перца через культуру пыльников//Тез. докл. II междунар. конф. "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология". Алматы, 1993. С. 160.
51. Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Лахвич Ф.А. Перспективы практического применения брассиностероидов - нового класса фитогормонов (обзор) //С-х биология. 1995. N 1. С. 3-11.
52. Чайлахян М.Х. Гормональная регуляция роста и развития высших растений//Успехи соврем. биологии. 1982. Т. 95. Вып. 1.
- 22 -
С. 23-34.
53. Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Т. 1. Генеративные органы цветка/Ред. Батыгина Т.Б. СПб.: Мир и семья, 1994. 508 с.
54. Babbar Sh.B., Gupta Sh.C. Induction of androgenesis and cal-
lus formation in in vitro culfured anthers of a myrfaceous fruit tree (Psidium guajava L.)//Bot.Mag.Tokyo. 1986. V. 99. N 1053. P. 75-83.
55. Batygina T.B. Problems of morphogenesis in vivo and in vit-
ro//Abstr. Indo-Soviet sympos. "Embryology of crop plants". Delhi, 1977. P. 41.
56. Batygina T.B. Problems of morphogenesis in situ, in vivo and
in vitro//Proc. intern. sympos. "Plant tissue and cell culture: application to crop improvement". Prague: Czechosl. acad. sci. press, 1984. P. 43.
57. Batygina T.B...........................//Abstr. XI internat.
sympos. "Embryology and seed reproduction". Leningrad: Nauka, 1990. P. 17-....
58. Batygina T.B. Position of the phenomenon of embryoidogeny in
the system of flowering plant reproduction//Abstr. XI internat. sympos. "Embryology and seed reproduction". St.Petersburg: Nauka, 1992. P. 6-.
59. Blaydes D.F. Interaction.......... //Physiol. plant. 1966.
V. 19. N 13. P. 748-753.
60. Bojadjiev P., Cuong Ph. V. Cytological and physiological
studies of some varieties and F1 hybrids of rice, Oruza sativa, uging the method of anther culture //Bionature. 1988. V. 8. N 1.
P. 41-46.
61. Chen Ch.-Ch., Tsay H.-Sh., Huang Ch.-R. Rice (Oruza sati-
va): factors affecting androgenesis //Crops I. Berlin, 1986. P. 123.
62. Chu Ch.-Ch. The N6 medium and its application to anther
culture of cereal crops //Proc. sympos. on Plant Tissue Culture. Peking: Sci. Press, 1978. P. 43-50.
63. Chua B.-Kh., Chen Y.-H., Omar O. Anther culture of rice
hybrids 1854 and 1856 //MARDI Res. Bull. 1984. V.12. N 3. P. 275-280.
64. Chuang Ch.-Ch., Quyang T.-W. A set of potato media for whe-
- 23 -
at anther culture //Proc. sympos. on Plant Tissue Culture. Peking: Sci. Press, 1978. P. 51-56.
65. Corduan G. Regeneration of anther-derived plants of Hyos-
cyamus niger L. //Planta. 1975. V. 127. N 1. P. 27-36.
66. Gamburg O.L., Eveleigh D.E. Culture methods and defection
of glucanases in cultures of wheat and barley //Canad. J. Biochem. 1968. V. 46. N 5. P. 417-421.
67. Geler T., Kohlenbach H.W. Entwicklung von Embryonen und
embyogenem kallus ans pollen kornern von. Datura meteloides and D. innoxie //Protoplasma. 1973. V. 78. N 2. P. 381-396.
68. Gorbunova V.Yu., Kruglova N.N. Androgenesis in vitro:
physiological aspects of the phenomenon in cereals //Proc. XIII intern. Congress on Sexual Plant Reproduction. Vienna, 1994. P. 36.
69. Gorbunova V.Yu., Kruglova N.N. Genetical determination of
the cerel androgenesis in vitro: hormonal aspects //Proc. XIV internat. Congr. on Sexual Plant Reproduction. Melbourne, 1996. P. 146-...
70. Gorbunova V.Yu., Kruglova N.N. Physiological aspects of
the androgenesis i
n vitro in cereals //Тез. докл. VIII междунар. конф. "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда". М., 1997. С. 31-...71. Gorbunova V.Yu., Nadolskaya S.N., Basharkina N.V., Kudo-
yarova G.R. Abscisic and embryogenesis in sprig wheat anther culture //Abstr. XI internat. sympos. "Embryology and seed reproduction". Leningrad: Nauka, 1990. P. 53-...
72. Govil S., Babbar S.B., Gupta S.C. Plant regeneration from
in vitro cultured anthers of black mustard (Brassica nigera Koch) //Plant Breed. 1986. V. 97. N 1. P. 64-71.
73. Grill E. Genetic analyss of abscisic acid action in Ara-
bidopsis thaliana: Abstr. Pap. Annu. Meet. Amer. Soc. Plant Physiologists, Portland, Ore., July 30 Aug. 3, 1994. //Plant Physiol. 1994. V. 105. N 1. Suppl. P. 9-....
74. Guha S., Maheshwari S. In vitro Production of Embryos
from anther of Datura //Nature. 1964. V. 204. N 4957. P. 497.
75. Hassawi D.S., Qu J., Liang G.N.//Plant Breed. 1990. V. 104.
N 1. P. 40.
76. Koinuma K., Mochizuki N., Inoue Y. Embryoid and callus
- 24 -
induction and plant regeneration by anther culture of Japanese local varientles of maize (Zea mays L.) //Bull. Nat. Grassland Res. Inst. 1990. N 43. P. 13-22.
77. Kucera L., Kucerova D. Optimization of doubled haploids
induction in wheat and barley by anther and microspore culture //Res. Inst. Crop Prod. Annu. Rep. 1994. P. 18-...
78. Lashermes P., Engin G., Ortiz-Ferrara G. Anther culture
of wheat (Triticum aestivum) adapted to dry areas of West Asia and North Africa //Genet. and Breed. 1991. V. 45. N 1. P. 33-...
79. Liang G.H., Xu A., Hoang-Tang. Direct generation of wheat
haploids via anther culture//Crop Sci. 1987. V. 27. N 2. P. 336.
80. Lichter R. Efficient yield of embryoids by culture of
isolated microspores of different Brassicacea species //Plant Breed. 1989. V. 103. N 2. P. 119-123.
81. Lillo C., Hansen M. Anther culture of cabbage. Influence
of growth temperature of donor plants and media composition on embryo yield and plant regeneration //Norw. J. Agr. Sci. 1987. V. 1. N 2. P. 105-109.
82. Loh C.-S., Ingram D.S., Hanke D.E. Cytokinins and the re-
generation of plantlets from secondary embryoids of winter oilseed rape Brassica napus ssp. Oleifera //New Phytol. 1983. V. 95. N
3. P. 349-158.
83. Moieni A., Sarrafi A. The effects of gibberllic acid, phe-
nylethylamine, 2,4-D and genotype on androgenesis in hexaploid wheat (Triticum aestivum) //Cereal Res.Commun. 1996. V.24. N 2. P. 139-145.
84. Murashige T., Skoog F...............//Physiol. plant. 1962.
V. 15. N 13. P. 473-...
85. Narayanaswamy S., Chandy L.P. In vitro induction of haplo-
id, diploid and triploid androgenic embrioids and plantlets in Datura metel L.//Ann. Bot. 1971. V.35. N 7. P. 535-542.
86. Phippen C., Ockendon D.J. Genotype, plant, bud size and
media factors affecting anther culture of cauliflowers (Brassica oleracea var. botrytis) //Theoret. and Appl. Genet. 1990. V. 79. N 1. P. 33-38.
87. Radojevic L., Djordjevic N., Tucic B. In vitro induction
of pollen embryos and plantlets in Aesculus carnea Hayne through anther culture //Plant Cell, Tissue and Organ Cult. 1989. V. 17.
- 25 -
N 1. P. 21-26.
88. Raghavan V. Induction of haploid plants from anther cultu-
res of henbane //Z.Pflanzenphysiol. 1975. V. 76. N. 1. S. 89-92.
89. Raghavan V. Origin and development of pollen embryoids and
calluses in cultured anther segments of Hyoscyamus niger (Henbane) //Amer. J. Bot. 1978. V. 65 (9). P. 984-1002.
90. Raghavan V., Nahmani R. Cytokinin effects on pollen embryo-
genesis in cultured anthers of Hyoskyamus niger //Canad. J. Bot. 1989. V. 67. N 1. P. 247-257.
91. Rashid A., Street H.E. The development of haploid embryoids
from anther cultures of Atropa beladonna L.//Planta. 1973. V. 113. N 3. P. 263-270.
92. Reddy V.S., Leelavathi S., Sen S.K. Influense of genotype and culture medium on microspore callus induction and green plant regeneration in anthers of Oryza sativa //Physiol. plant. 1985. V. 63. N. 3. P. 309-314.
93. Reynolds Th.L. Ethelene effects of pollen callus formation and organogenesis in anther culture of Solanum carolinense L. //Plant Sci. 1989. V.61. N 1. P. 131-136.
94. Rose Ju.B., Dunwell J.M., Sunderland N. Anther culture of
Soryhum bicolor (L). Moench . I. Effect of panicle pretreatment, anther incubatoin temperature and 2,4-D concentration //Plant Cell Tissue Organ Culture. 1986. V. 6. N 1. P. 15-22.
95. Schumann G. //Arch.Zucht. 1987. B. 17.
H. 1. S. 27.
96. Shimada T., Otani M.//Jap.J. Breed. 1989. V. 39. N 2. P. 187-194.
97. Skoog F. Aspects of growth factor interaction in morphogenesis of tobacco tissue cultures //Les cultures de tissus de plantes. Paris, 1971. P. 115.
98. Skoog F., Miller C.O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro //Sympos. Soc. Exp. Biol. 1957. V. 11. N 2. P. 118.
99. Siebel J., Pauls K.P. A comparison of anther and microspore culture as a breeding fool in Brassica napus //Theoret. and Appl. Genet. 1989. V. 78. N 4. P. 473-479.
100. Sopory S.K., Maheshwari S.C. Development of pollen embryoids in anther cultures of Datura innoxia II Effects of growth hormones//J. Exptl Bot. 1975. V. 27. N 96. P. 58-68.
101. Sunderlan N., Wicks F.........//J. Exptl Bot. 1971. V. 22. N 70. P. 213.
102. Tsay S.S., Miao S H., Widholm J.M. Factors affecting haploid plant regeneration from maize anther culture//J.Plant Physiol. 1986. V. 126. N 1. P. 33-40.
103. Wilen R.W., Mandel R.M., Pharis R.P., Holbrooc L.A., Moloney M.M. Effects of abscisic acid and high osmoticum on storage protein gene expression in microspore embryos of Brassica napus//Plant Physiol. 1990. V. 94. N 3. P. 875-881.
104. Williams B.A., Tsang A. Analysis of multiple classes of abscisic acid-responsive genes during embryogenesis in Zea mays//Dev. Genet. 1994. V. 15. N 5. P. 415-424.
105. Ye J.M., Harvey B.L., Kao K.N. Effects of 2,4-D and zeatin riboside on pollen callus induction in barley anther culture//Canad. J. Plant Sci. 1985. V. 65. N 1. P. 29-32.
106. Yonova P.A., Vassilev G.N., Izvorska N.D. Action of unconventional cytokinins and auxins on the callusogenesis of plant tissue cultures //Докл. Бълг. АН. 1994. Т. 47. N 1. С. 61-64.
107. Zhong H.-M., Pan X.-Q., Chen H.-M.....//Acta bot. yunnanica. 1992. V. 14. N 2. P. 179-186.
108. Zhou H., Konzak S.F. Improvement of anther culture methods for haploid production in wheat //Crop. Sci. 1989. V. 29. N 3. P. 817-821.
109. Ziauddin A., Marsolais A., Simion E., Kasha K.J. Improved plant regeneration from wheat anther and barley microspore culture using phenylacetic acid (PAA) //Plant Cell Repts. 1992. V. 11. N 10. P. 489-493.